匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立

李 鑫， 高佩然， 边秀举， 王丽宏， 李会彬， 刘 畅， 董康挺， 孙鑫博

(河北农业大学农学院/河北省作物生长调控重点实验室， 河北 保定 071000)

植物原生质体是指细胞壁以内的原生质部分，即细胞通过质壁分离后，去除细胞壁的由质膜包被的裸露细胞，具有细胞全能性，其广泛应用于植株再生[1]、体细胞杂交[2]、基因功能研究[3]、植物生化过程研究[4]等。自1960年Cocking等[5]首次利用纤维粗制酶，从番茄(Solanumlycopersicum)根尖分离出原生质体以来，现已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[6]和烟草(NicotianatabacumL.)[7]中建立了原生质体分离系统。马晖玲等[8]在草地早熟禾(PoapratensisL.)‘午夜Ⅱ号’中建立了原生质体分离和培养体系，并再生出完整植株；李妮娜[9]在陆地棉(GossypiumhirsutumLinn.)中建立了原生质体分离体系，并以此为受体获得了能够有效表达融合蛋白的原生质体瞬时表达系统。然而在匍匐翦股颖中并未有成功分离原生质体的报道，因此高效遗传转化技术的开发可为后期匍匐翦股颖的基因功能研究提供基础。

瞬时表达是近年来发展的一种快速的、高效的检测蛋白质表达的方法，逐渐应用到生物学各研究领域中[10]。同时，原生质体作为一种理想的单细胞系统，因没有细胞壁的限制，成为构建植物瞬时表达体系的良好试验材料[11]。在植物原生质体中进行瞬时表达时间短、重复性好、转化效率高，被广泛应用到基因克隆与分析、启动子活性、亚细胞定位、蛋白质互作分析等方面[10]。尹启琳[12]通过瞬时表达系统，构建了小麦(TriticumaestivumL.)‘济麦22号’TaCKX1基因靶向编辑载体，并通过测序检测了相关基因突变。Zhang等[13]利用瞬时表达系统，在水稻(OryzasativaL.)原生质体中进行了蛋白质免疫印迹分析、亚细胞定位、双分子荧光互补试验，并通过相关转录因子的上调研究光反应过程。对于匍匐翦股颖高效遗传转化体系的研究缺乏，因此建立其瞬时表达体系将有利于基础功能研究的发展。

匍匐翦股颖是一种常见的冷季型草坪草，它属于禾本科翦股颖属多年生草本[14]。匍匐翦股颖原产于欧亚大陆，在我国华北、东北、西北均有分布，其叶片质地良好、匍匐茎发达，低矮致密的叶片结构能够形成观赏性较强的草坪，以及良好的耐低修剪、耐寒性、耐阴性、耐践踏性等特性[15]。此外，匍匐翦股颖耐盐性极强，对重金属也有良好的吸收作用，因此，也可以作为盐碱地修复、矿山恢复的生态草种[16]。但由于匍匐翦股颖是一种异源多倍体植物，其种子生产困难，并具有自交不亲和性的遗传特性，很难通过传统育种方法来进行遗传改良。因此，通过基因工程手段进行匍匐翦股颖的遗传改良已成为研究的热点。目前，匍匐翦股颖转基因技术较为成熟[17]，然其瞬时表达体系研究较为滞后，严重制约了匍匐翦股颖在分子生物学领域的发展。

本试验以匍匐翦股颖‘Penn-A4’为研究对象，探讨各因素对原生质体制备的影响，旨在为今后匍匐翦股颖体细胞杂交、遗传转化、产业育种等研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取匍匐翦股颖‘Penn-A4’的无菌苗叶片为材料，进行叶肉原生质体的分离。

无菌苗的培养：将种子放入灭菌过的50 ml离心管中，加入消毒剂(成分：次氯酸钠漂白剂20%，无菌水80%)，将离心管在150 r·min-1的摇床上室温摇晃30 min。在超净工作台中倒掉消毒剂，用无菌水冲洗种子5遍直至洗净，将种子放在干净滤纸上吹干，然后用镊子均匀铺在灭过菌的MS培养基上，封好瓶口，温度25 ℃、湿度40%、光周期为12 h光照/12 h黑暗、无菌条件下培养。

1.2 试验试剂

酶解液：1.5%的纤维素酶、0.5%的果胶酶、0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1MES，4 mmol·L-1CaCl2、0.1%的β-巯基乙醇和250 mg·L-1头孢噻肟。

W5溶液：154 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1CaCl2，5 mmol·L-1KCl和2 mmol·L-1MES。

MMG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇、15 mmol·L-1MgCl2和4 mmol·L-1MES。

40% PEG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇，100 mmol·L-1CaCl2和40% PEG4000(聚乙二醇4000)。

1.3 试验设计

设计重复梯度试验，分别改变植物培养时间、酶液渗透压、酶解时间中的一个变量，确定匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离的最佳体系。1)不同的植物培养时间。培养时间2，3，4和6周、酶液甘露醇浓度0.6 mol·L-1、酶解时间4 h；2)不同的酶液渗透压。常用的渗透压稳定剂主要有甘露醇、蔗糖、山梨醇等，其中甘露醇在原生质体分离中的应用最为广泛[18]。培养时间4周、酶解时间4 h、酶液甘露醇浓度0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1；3)不同的酶解时间。培养时间4周、酶解时间2，3，4和5 h、酶液甘露醇浓度0.6 mol·L-1。

1.4 原生质体提取方法

用全新的、锋利的刀片将匍匐翦股颖无菌苗的叶片在含0.6 mol·L-1甘露醇浸泡液的无菌培养皿中切割细碎。用镊子将细碎叶片迅速放入含15 mL酶解液的无菌培养皿中浸没，放置摇床中28 ℃，40 r·min-1振荡培养。酶解完成后的材料用滤布(Miracloth)过滤，除去未完全酶解的原生质体和杂质。将滤液在1000 r·min-1条件下离心5 min，去掉上清液收集原生质体。向原生质体加入预冷的15 mL W5溶液，低速(30 rpm)震荡1 h使其悬浮，用Miracloth过滤，1000 r·min-1离心5 min，弃上清。再次用预冷的W5溶液洗涤原生质体，弃上清，以W5溶液重悬后收集纯净的原生质体。用血球计数板统计匍匐翦股颖原生质体数量，取分离纯化后的原生质体悬浮液滴在载玻片上，在光学显微镜下观察原生质体质量及数量，计数中央大方格内原生质体数量，重复计数3次。

原生质体的密度(个·mL-1)=大方格(0.1 mm3，即0.1 μL)的原生质体数×104

1.5 瞬时表达载体的构建

PUC质粒载体中含有35S启动子和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，能够在真核细胞中高水平表达，可以被用作亚细胞定位质粒载体。AsHSP26.8基因是一个叶绿体定位的小热激蛋白，已在水稻原生质体中证实其定位在叶绿体中[19]。根据AsHSP26.8基因序列设计两端带有BamHI酶切位点的引物AsHSP26-F:AGGATCCATGGCTGCA-GCGAACGCCCCCTTC;AsHSP26-Loc-PUC-R:GGGATCCACTGGACCTGCACGTCGATGACC，以高温处理过的野生型匍匐翦股颖cDNA为模板进行扩增(表1)，构建融合蛋白表达载体PUC-AsHSP26.8。

表1 PCR扩增条件

1.6 原生质体的转化与观察

将收集好的原生质体重悬浮于MMG溶液中。分别将2 μg GFP空载体和融合蛋白表达载体PUC-AsHSP26.8放入1.5 mL离心管中，加入100 μL Mmg重悬液混匀后，然后加入70 μL的40% PEG溶液，轻轻混匀后室温放置15 min以完成转化。随后用30 mL的W5溶液重新悬浮原生质体溶液，常温条件下过夜培养，在激光共聚焦显微镜下观察GFP绿色荧光蛋白信号。

1.7 数据分析

使用NCBI的BLAST工具进行序列比对和分析；使用Primer 5.0软件进行引物设计。

2 结果与分析

2.1 匍匐翦股颖叶肉原生质体的分离

以无菌环境中培养了4周的匍匐翦股颖无菌幼苗幼嫩叶片为试验材料(图1a)，按本文“1.4”的方法进行操作(图1b)，收集得到明显的聚集在一起的原生质体(图1c)。用光学显微镜观察得到的原生质体，杂质少，体积大，数量多(图1d)，可进行下一步的遗传转化试验。

图1 匍匐翦股颖原生质体的分离

2.2 原生质体提取条件优化

2.2.1无菌苗培养时间对原生质体分离的影响 原生质体的提取效率与植物组织类型及植物叶片幼嫩程度有关系，首先需要确定原生质体提取分离效果最佳的无菌苗培养时间。本研究选择培养时间为2，3，4和6周的无菌苗材料，酶解后分别检测分离原生质体的产量。原生质体个数随着培养时间呈现上升后下降的趋势。培养4周的无菌苗得到原生质体的平均产量均显著高于其他培养时间(P<0.05)，达到最高值为6.75×106个·g-1(表2；图2a)。所以最适的材料是培养4周的无菌苗。

2.2.2酶液渗透压对原生质体分离的影响 酶液渗透压直接影响到原生质体的质量，分别选取甘露醇浓度为0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1的不同渗透压条件下进行原生质体的提取。甘露醇浓度为0.4 mol·L-1时，原生质体平均产量为1.85×106个·g-1，0.5 mol·L-1时为3.90×106个·g-1，0.6 mol·L-1时为6.75×106个·g-1，0.7 mol·L-1时为4.70×106个·g-1。其中浓度为0.4 mol·L-1时原生质体产量最低，0.6 mol·L-1时产量最高，且和其他浓度相比达到差异显著水平(P<0.05)(表2；图2b)。所以选择酶液渗透压为0.6 mol·L-1甘露醇浓度。

2.2.3酶解时间对原生质体分离的影响 在适宜的酶解液、培养时间和渗透压的条件下，酶解反应时间也能够明显影响提取原生质体的产量和活力。酶解2 h时的原生质体产量最低为4.50×106个·g-1，酶解3 h和5 h时的平均产量相当，无显著性差异，酶解时间4 h时原生质体产量最高为6.75×106个·g-1，且原生质体破裂数量相较最少(表2；图2c)。所以选择4 h为合适的酶解时间。

表2 不同条件下的原生质体产量

图2 不同条件下的原生质体产量

2.3 亚细胞定位载体构建

从基因组数据库中下载AsHSP26.8的基因序列，根据序列信息设计引物，以高温处理过的野生型匍匐翦股颖cDNA为模板，用Taq酶进行扩增，片段长度约为700 bp(图3a)。将扩增片段连上载体pGEM-T Easy，转化到DH5α大肠杆菌感受态中，进行菌落PCR验证和测序，提取正确的pGEM-AsHSP26.8质粒。然后分别对pGEM-AsHSP26.8和PUC载体进行BamHI单酶切。将pGEM-AsHSP26.8单酶切后的小片段(约700 bp)和单酶切后的PUC载体(约5 000 bp)(图3b)，使用T4连接酶进行连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌斑，扩大培养并提取PUC-AsHSP26.8质粒，经酶切(图3c)与测序鉴定，完成PUC-AsHSP26.8重组载体的构建。

图3 PUC-AsHSP26.8载体的构建

2.4 亚细胞定位分析

分别将AsHSP26.8-GFP和GFP空载体通过PEG介导入制备好的匍匐翦股颖原生质体,室温条件下培养12 h后，在激光共聚焦显微镜下观察结果。在激发光为488 nm条件下，AsHSP26.8-GFP和GFP空载体观察到了绿色荧光；在激发光为580 nm条件下，观察到原生质体叶绿体自发荧光呈现红色荧光(图4)。GFP空载体的荧光蛋白定位于整个细胞质中，构建的质粒AsHSP26.8-GFP定位于叶绿体上，与AsHSP26.8[19]在水稻的原生质体定位情况一致。上述结果表明，提取的匍匐翦股颖原生质体可用于蛋白亚细胞定位等相关分析。

图4 AsHSP26.8-GFP和GFP空载体的亚细胞定位

3 讨论

匍匐翦股颖作为一种具有众多优良性状的观赏性草坪草，由于其转基因技术复杂、耗时长、表达水平低使得其在遗传转化方面的研究受到了限制，而通过利用原生质体进行瞬时转化克服了这一障碍。目前，关于分离匍匐翦股颖原生质体和制备瞬时转化体系的研究未见报道。因此，本研究在拟南芥原生质体制备的基础上，通过优化原生质体分离条件，首次建立了匍匐翦股颖原生质体分离制备瞬时转化体系，该体系可以为其它草坪草的瞬时转化体系的建立提供参考。

目前常用的原生质体分离方法与Yoo等[6]在拟南芥构建的原生质体瞬时表达体系相似，多以叶肉为材料通过纤维素酶和果胶酶酶解分离得到原生质体，并使用离心法纯化。植物的各个器官如根、茎、叶、种子及愈伤组织等都能分离出原生质体[20]。目前许多禾本科植物如小麦[12]和柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[21]制备原生质体所采用的试验材料是黄化苗，而匍匐翦股颖幼苗叶片细弱柔软，且在暗处和遮光培养时，难以得到足够的试验材料用于提取原生质体。同样又选用了土壤中培养的幼苗进行试验，提取到的匍匐翦股颖原生质体质量也不太理想。此外，与作物相比，匍匐翦股颖无菌苗生长速度相对较慢，植株相对细小，用于提取原生质体时，需要准备较多的试验材料。在今后的研究中我们将继续优化试验体系，期望能够快速产生无菌苗或者可以用在培养室里培养的小苗甚至是匍匐茎上生长的新的植株作为材料，从而大大提高试验效率。

由于植物原生质体没有细胞壁的保护和束缚，容易摄取外源DNA等遗传物质，原生质体制备会受很多因素影响[20]。获得植物高质量原生质体，需要优化酶液组合与浓度、酶解时间和酶解渗透压等几个关键因素[22]。其中最重要的是酶液渗透压，只有在维持一定的渗透压才能保证原生质体的产量及活力。本试验中发现对于匍匐翦股颖来说，最佳渗透压是0.6 mol·L-1，低于0.6 mol·L-1时原生质体会失水变瘪，造成多余碎片，过高导致吸水膨胀而破裂，直接影响原生质体产量。对比匍匐翦股颖与其他植物的原生质体分离体系，发现匍匐翦股颖所需的渗透压浓度和近缘物种如水稻[13]、柳枝稷[21]是一致的，可能由于亲缘关系相近的物种间细胞结构相似所致。酶解时间是另一个获得高质量原生质体的重要条件，分离原生质体是植物去除细胞壁的过程，所以细胞壁成分和外植体幼嫩程度会极大的影响提取原生质体的酶解时间。酶解时间过短，酶解过程不充分，无法分离出原生质体；酶解时间过长，会破坏已分离出的原生质体，影响获得的原生质体产量。本试验过程中选取培养4周的匍匐翦股颖无菌苗叶片，这一时期的叶片细胞幼嫩，细胞壁成分中纤维素含量较少，同时操作过程中将匍匐翦股颖叶片切割足够细碎，会缩短酶解时间，减少因酶解液过度酶解而造成原生质体破碎的情况。最佳组合下酶解4 h时就能够获得最多产量的原生质体，产量能达到6.75×106个·g-1，在一定程度上加快了试验进程。本试验得出本研究在获得的最佳组合条件下进行原生质体制备，获得的原生质体数量及大小均适用于亚细胞定位的试验观察。

4 结论

本研究建立了一套能够高效获取匍匐翦股颖原生质体的方法，以培养4周的匍匐翦股颖无菌苗叶片为材料，在甘露醇为0.6 mol·L-1的酶解液中酶解4 h能够获得产量为6.75×106个·g-1的原生质体。通过40% PEG-4000介导质粒转化匍匐翦股颖原生质体，观察到并证实小热激蛋白AsHSP26.8清晰定位在叶绿体上。利用该体系，有利于进行匍匐翦股颖基因亚细胞定位及功能研究。