乙酰肝素酶通过转录因子Runx2调控多发性骨髓瘤细胞功能

潘倩影 水 炜 牛媛媛 张常然

多发性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是一种血液系统恶性肿瘤，以克隆性的浆细胞在骨髓中异常增生为特征[1]。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是一种存在于哺乳动物体内的内源性β-D-葡萄糖醛酸酶，其可以切割细胞表面的乙酰肝素链，使连接在乙酰肝素链上的具有生物学活性的细胞因子，如FGF-2、HGF、TGF-β、PDGF、KGF等释放到骨髓微环境中，通过与骨髓微环境中的各种细胞表面受体结合，调节各种细胞功能[2]。HPSE被发现在MM患者中表达升高，且与MM患者的不良预后密切相关；在细胞和动物模型中，HPSE表达上调可以促进骨髓瘤细胞生长、转移以及肿瘤新生血管生成，但其中涉及的具体机制尚未完全阐明[3]。Runt相关的转录因子2(runt related transcription factor 2，Runx2)是Runt相关的基因家族成员，其作为骨和软骨形成相关的转录因子，被认为是骨形成的主要调控者之一[4]。近年来，Runx2被发现在包括MM在内的多种肿瘤中表达增高，且肿瘤中异常的Runx2表达与肿瘤骨转移、疾病进展以及不良预后密切相关[5]。在肿瘤细胞中，Runx2作为重要的转录因子可以被多种因素调节，也可以通过调控下游多种信号因子的表达影响细胞功能。关于HPSE与Runx2的关系，目前研究较少。本研究试图通过检测在不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中Runx2的含量以及Runx2对下游基因RANKL、MMP9调控等方式，以探讨在骨髓瘤细胞中HPSE与Runx2之间的关系。

材料与方法

1.试剂与材料：Runx2抗体(英国Abcam公司)，Lamin A/C抗体、β-actin抗体(美国Cell Signaling公司)，重组人HPSE(recombinant human heparanase，rhHPSE)药物(美国R&D公司)，HPSE抑制剂PD98059药物(美国Sigma-Aldrich公司)；人CAG骨髓瘤细胞系来自美国阿拉巴马大学伯明翰分校病理系Dr.Yang Yang实验室；CAG细胞通过转染包含HPSE cDNA的质粒载体构建HPSE过表达细胞即HPSE-high细胞，通过转染空质粒载体构建对照细胞即HPSE-low细胞；CAG细胞通过转染包含HPSE shRNA的慢病毒载体构建HPSE沉默表达细胞即HPSE k/d细胞，通过转染包含non-target shRNA的慢病毒载体构建对照细胞即shRNA control细胞。

2.目标基因质粒构建及转染：将人HPSE cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP真核表达载体 (Clontech，日本TaKaRa公司)中，构建出重组质粒。将重组质粒以及空载体与Lipofectin和Opti-MEM I转染试剂(Invitrogen，美国Thermo Fisher公司)混合后转染人CAG骨髓瘤细胞，细胞转染后予G418进行抗药性筛选及进行流式细胞仪GFP阳性细胞分选，得到稳定转染的HPSE过表达细胞以及对照细胞。

3.目标基因沉默表达：分别将包含HPSE shRNA以及non-target shRNA的慢病毒颗粒(美国Sigma-Aldrich公司)与人CAG骨髓瘤细胞共培养，48h后加入嘌呤酶素溶液进行耐药细胞筛选，药物浓度依据嘌呤酶素杀伤曲线所得，继续培养一段时间，待细胞获得重建并生长至较佳状态时，收取细胞，提取蛋白进行Western blot法检测，评估预定基因沉默表达情况，以筛选出效果最佳的HPSE k/d细胞以及对照细胞。HPSE shRNA序列：5′-CCGGCCATAATGTCACCAAG-TACTTCTCGAGAAGTACTTGGTGACATTATGGTTTTT-TG-3′，non-target shRNA序列：5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTC-ATCTTG-TTGTTTTT-3′。

4.细胞培养：人CAG骨髓瘤细胞用RPMI1640培养基、10%胎牛血清(美国Thermo Fisher公司)培养，培养液中加入100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、1% L-谷氨酰胺，培养环境为37℃、饱和湿度、5%CO2，培养液每2天更换1次，实验所用的细胞进入对数生长期后按照1∶3～1∶4的比例传代。

5.Western blot法：采用80μl RIPA细胞裂解液裂解细胞，旋涡振荡后再加入20μl 5×蛋白上样缓冲液，金属浴100℃加热40min。取等量总蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用PVDF膜70V恒压湿法转膜1h后，5%脱脂牛奶室温封闭1h，先后与一抗和二抗孵育，最后ECL显色。Western blot法条带采用Image J软件进行定量分析。

6.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)：经预处理的细胞用终浓度为1%的甲醛溶液固定10min，使转录因子与DNA交联，用细胞裂解液破膜后，通过超声将DNA打碎成250～1000bp片段。用Runx2特异性抗体沉淀DNA-蛋白复合物，用蛋白A+G琼脂糖吸附复合物，经洗去非特异性吸附后，解交联，沉淀的DNA片段于-20℃保存备用。

7.qPCR扩增ChIP后DNA产物：针对RANKL启动子、MMP9启动子区域的DNA序列设计引物，RANKL启动子引物：(F)5′-CAGAAGATGGCACTCACTGCA-3′，(R)5′-CACCATCGCTTTCTCTGCTCT-3′;MMP9启动子引物：(F)5′-TGACAGCGACAAGAAGTG-3′，(R)5′-CAGTGAAGCGGTACATAGG-3′。扩增条件：94℃ 5min 预变性，94℃ 变性30s，退火温度 30s，72℃ 1min，35个循环后，每个循环结束后进行荧光信号收集。每个反应设3个复孔，以2-ΔΔct计算DNA相对表达水平。

结 果

1.不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中转录因子Runx2的表达含量：为了研究在骨髓瘤细胞中HPSE与转录因子Runx2的相关性，笔者检测不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中Runx2的表达含量。首先，通过转染质粒的方法构建HPSE过表达骨髓瘤细胞HPSE-high和对照细胞HPSE-low，通过Western blot法检测发现与对照细胞比较，HPSE-high骨髓瘤细胞中Runx2表达升高；通过转染包含shRNA慢病毒颗粒的方法构建HPSE沉默表达骨髓瘤细胞HPSE k/d和对照细胞shRNA control，通过Western blot法检测发现与对照细胞比较，HPSE k/d骨髓瘤细胞中Runx2表达减少；其次，在培养HPSE低表达的骨髓瘤细胞HPSE-low时加入不同浓度外源性的rhHPSE，培养48h后，通过Western blot法检测发现随着药物浓度的增加，HPSE-low骨髓瘤细胞中Runx2的表达逐渐升高；再次，在培养HPSE过表达的骨髓瘤细胞HPSE-high时加入HPSE抑制剂PD98059，培养48h后，通过Western blot法检测发现与对照组比较，加入HPSE抑制剂可抑制HPSE-high骨髓瘤细胞中Runx2的表达(图1)。

图1 不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中转录因子Runx2的表达含量A.不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中Runx2的表达；B.在HPSE-low骨髓瘤细胞培养过程中加入不同浓度的rhHPSE，Western blot法检测Runx2的表达；C.在HPSE-high骨髓瘤细胞培养过程中加入HPSE抑制剂PD98059，Western blot法检测Runx2的表达

2.不同HPSE表达水平的骨髓瘤细胞中转录因子Runx2结合RANKL、MMP9启动子区域的DNA含量：为了研究在HPSE高表达骨髓瘤细胞中转录因子Runx2对下游基因的调控作用是否增强，采用染色质免疫共沉淀的方法，在HPSE高表达骨髓瘤细胞HPSE-high与对照细胞HPSE-low中，使用Runx2特异性抗体沉淀DNA-蛋白复合物，采用qPCR的方法分别检测转录因子Runx2所结合的与骨髓瘤细胞侵袭功能相关的重要分子RANKL、MMP9启动子区域DNA表达含量，发现与对照细胞比较，HPSE-high骨髓瘤细胞中转录因子Runx2结合的RANKL、MMP9启动子区域DNA含量显著升高(图2)。

图2 不同HPSE表达水平骨髓瘤细胞中转录因子Runx2结合RANKL和MMP9启动子区域的DNA含量与HPSE low组比较，*P<0.05

讨 论

多发性骨髓瘤(MM)是一种来源于浆细胞的恶性肿瘤，约占血液系统肿瘤的10%。MM以恶性的浆细胞增生、血清和尿中存在单克隆免疫球蛋白为特征，其可以导致贫血、肾功能不全、广泛的骨损害、高钙血症以及严重的感染等一系列不良事件[1]。尽管在过去的20年间针对MM的治疗已取得很大进展，但MM仍旧不可治愈[6]。因此，有待识别更多的分子靶点以用于新药的研发。

乙酰肝素酶(HPSE)是一种内源性β-D-葡萄糖醛酸酶，其在MM患者中高表达，且与不良预后密切相关[3,7]。HPSE的上调促进骨髓瘤细胞生长、骨转移和新生血管生成，但其中所涉及相关机制尚待进一步研究[8,9]。笔者研究显示骨髓瘤源性的HPSE可作用于骨髓微环境，诱导骨髓瘤细胞展现间质样特征，增加其播散至远处的能力，促进骨髓瘤骨转移的发生[10]。Runx2是Runt相关的基因家族成员，其作为骨和软骨形成相关的转录因子，被认为是骨形成的主要调控者之一[4]。近年来Runx2被发现在包括MM在内的多种肿瘤中表达增高，且肿瘤中异常的Runx2表达与肿瘤骨转移、疾病进展以及不良预后密切相关[11]。Trotter等[12]研究发现，骨髓瘤细胞中Runx2表达增高可以促进骨转移的发生，其可以作为骨髓瘤骨病的一个主要调控因子。关于HPSE与Runx2的关系，目前尚无文献报道HPSE可以直接促进Runx2的活化，但HPSE切割后的硫酸乙酰肝素蛋白多糖链可以协同FGF2信号调控Runx2的表达和活化[13]。笔者研究发现在骨髓瘤细胞中转录因子Runx2的表达含量同步于HPSE表达水平，提示HPSE可能通过直接或间接的方式促进转录因子Runx2的表达和活化。

研究显示，在骨髓瘤细胞中HPSE促进肿瘤细胞发生骨转移和新生血管生成通过调控相关蛋白的表达实现。其中，RANKL属于肿瘤坏死因子超家族的成员，主要由骨髓基质细胞、成骨细胞和活化的T淋巴细胞产生。在正常情况下，巨噬细胞集落刺激因子可以刺激前体破骨细胞数目增加，RANKL通过与前体破骨细胞上RANK受体相结合，刺激其分化为成熟破骨细胞并且减少破骨细胞凋亡，进而增加破骨活性[14]。在MM中，骨髓瘤细胞在与骨髓微环境作用下可刺激骨髓基质细胞和成骨细胞产生更多的RANKL，增加骨质破坏。Yang等[15]研究发现，骨髓瘤细胞中HPSE的表达可以刺激RANKL表达和分泌，引起局灶性和系统性的溶骨性骨破坏。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类锌依赖的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)重塑内肽酶，具有降解ECM成分的功能。ECM的降解与肿瘤细胞转移和血管生成密切相关，因此，MMPs被认为是肿瘤生长和血管生成强有力的启动子。在MM中，MMP9的表达增高，且与疾病复发和短的生存期密切相关。Purushothaman等[16]研究显示，骨髓瘤细胞中HPSE的表达升高促进MMP9的表达和分泌增多，从而增加肿瘤细胞的侵袭性表型。Runx2作为转录因子可以激活包括RANKL、MMP9等多种下游的靶基因，导致肿瘤细胞的多种行为发生改变[17，18]。笔者研究发现HPSE高表达的骨髓瘤细胞中转录因子Runx2结合RANKL、MMP9启动子区域的DNA含量增高，提示HPSE高表达的骨髓瘤细胞可以通过转录因子Runx2调控使RANKL、MMP9的表达增加，进而增强骨髓瘤细胞的骨转移和侵袭性特征。因此，笔者提出HPSE可通过转录因子Runx2调控骨髓瘤细胞的功能。

综上所述，本研究验证了在骨髓瘤细胞中HPSE表达增高可以促进转录因子Runx2的表达，同时可以通过增加Runx2与调控RANKL、MMP9启动子区域DNA相结合的方式达到调控骨髓瘤细胞功能的目的。该研究探讨了HPSE可以促进MM疾病进展中的相关机制，HPSE及Runx2有望成为治疗MM的分子靶点。今后将在临床样本中验证HPSE与Runx2的相关性，以及探寻在骨髓瘤细胞中HPSE促进Runx2表达和活化的相关机制。