TSPAN13在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系
2021-10-18周蓓樊利春吴沉昊王婧
周蓓 樊利春 吴沉昊 王婧
乳腺癌具有异质性,治疗方案因人而异。手术、靶向药物有了很大发展,但治疗效果仍不明显。TSPAN13(又称NET-6)属于四肽超家族,染色体位于7p21.1,TSPAN13基因编码含204个氨基酸的蛋白质,参与了一系列的生物学过程,包括分化、凋亡、增殖和转移等[1]。Iwai等[2]研究发现,乳腺癌细胞株细胞中TSPAN13低表达,是乳腺癌的抑癌基因。我们采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)及Western blot法检测了乳腺癌组织中TSPAN13表达,分析TSPAN13表达水平与临床病理特征的关系。
对象和方法
一、对象
2017年1月~2019年1月我院接受乳腺癌根治手术治疗的乳腺癌病人96例。纳入标准:(1)女性,均明确诊断为乳腺癌;(2)术前未行放化疗、内分泌治疗等;(3)临床资料完整;(4)签订知情同意书,并上报医院伦理道德委员会批准。排除标准:合并其他器官肿瘤;严重精神疾病;合并严重的心、肝、肾疾病。96例相应的癌旁正常乳腺组织(距癌灶>5 cm)作为正常组。10例良性病变组织(纤维腺瘤)作为对照。96例乳腺癌病人一般资料见表1。
表1 病人基线资料
二、方法
1.qRT-PCR法检测组织中TSPAN13 mRNA表达水平:超声粉碎组织,PBS溶液洗涤溶解,加入等体积TRIzol试剂。根据试剂盒说明书提取总RNA,溶于20 μl DEPC水,取1 μl加入79 μl DEPC水测OD260/OD280检测纯度。根据反转录试剂盒(武汉博士德公司)合成cDNA,样品总RNA 1 μg,随机引物或oligo-dT(18-20) 100 pmol,脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各10 mmol/L) 1 μl,反转录缓冲液(5×) 4 μl,RNase抑制剂(20~40 U/μl ) 1 μl,M-MLV反转录酶20 U,DEPC处理水补至20 μl,目标引物序列由北京华大基因生物有限公司合成(表2)。根据试剂盒说明书进行PCR扩增:cDNA 2 μl、上下引物各3 μl、Taq聚合酶0.5 μl,总体积共25 μl,反应参数设置为92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s,共40个循环。构建溶解曲线,2-△△Ct法表示目标引物mRNA的相对表达量。
表2 引物序列
2.Western blot法检测组织中TSPAN13蛋白表达水平:无菌条件下取组织,加2 m1 RIPA组织裂解液,充分混合,冰浴30分钟,40 ℃ 1 000 r/min离心15分钟,去上清,超声波破核,离心,留上清进行检测。配胶,上样,电泳,转膜,切膜,封闭液封闭1小时,逐次大鼠抗人TSPAN13(1∶100,Santa Cruz,美国)、β-actin单克隆抗体(1∶50,Santa Cruz,美国)、辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶100,Santa Cruz,美国)。Bio-Rad成像仪曝光成像,Image Lab Software测定光密度,以TSPAN13与β-actin条带比值表示相对表达量。
三、 统计学方法
结果
1.乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性肿瘤组织中TSPAN13 mRNA表达:乳腺癌组织中TSPAN13 mRNA表达水平(0.25±0.04)低于癌旁组(0.52±0.08)、乳腺良性肿瘤(0.48±0.05)差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。
注:与乳腺癌组织比较,aP<0.001
2.乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性肿瘤组织中TSPAN13蛋白表达:乳腺癌组织中TSPAN13蛋白水平(0.31±0.04)低于癌旁组织(0.57±0.07)、乳腺良性肿瘤(0.56±0.02),差异具有统计学意义(t=31.598,30.984,P=0.000,0.000),见图2。
A:Western Blot检测结果;B:各组TSPAN13蛋白相对水平统计学分析。与乳腺癌组织比较,aP<0.001
3.乳腺癌组织TSPAN13 mRNA表达水平与临床病理特征的相关性:高、中分化乳腺癌组织中TSPAN13表达量高于低分化,无远处转移乳腺癌组织中TSPAN13表达量高于有转移乳腺癌组织,I+Ⅱ期乳腺癌组织中TSPAN13表达量高于Ⅲ期乳腺癌组织,HER2(-)乳腺癌组织中TSPAN13表达量高于HER2(+)乳腺癌组织,ER(-)、PR(-)乳腺癌组织中TSPAN13表达量低于ER(+)、PR(+)乳腺癌组织,Ki-67指数<14%乳腺癌组织中TSPAN13表达量低于Ki-67指数≥14%乳腺癌组织(P=0.001,0.001,0.001,0.000,0.004,0.000)。在年龄、部位、肿瘤直径、HER2+ER+PR状态组中表达无差异(P>0.05)。见表3。
表3 乳腺癌组织TSPAN13蛋白表达水平与临床病理特征的相关性(例)
讨论
乳腺癌病理分型差异较大,容易出现远处转移。随着蛋白组学和基因组学的开展,通过检测相关生物蛋白标志物,有助于预测预后,制定有针对性的个体化治疗方案[3]。目前已经筛选出了一系列肿瘤标志物,如催乳素(PRL)、血管内皮生长因子(VEGF)等[4],但尚无一种敏感度高的标志物。
TSPANl3是一种跨膜蛋白,在膜蛋白构建和细胞信号传导中发挥重要作用。TSPANl3基因位于染色体7p21.1,TSPANl3基因的缺失与肾母细胞瘤的发生有关[5]。Yan等[6]筛选前列腺癌候选基因时发现,TSPANl3与S100A9比值可用于前列腺癌的早期诊断。Wang等[7]利用生存分析数据库对TSPANl3与乳腺癌病人预后的关系进行了检索、分析,结果显示,乳腺癌组织低表达TSPANl3病人生存时间比高表达病人短。
Huang等[8]研究发现,下调TSPAN13可增强乳腺癌细胞的侵袭、增殖能力。我们采用qRT-PCR、Western blot法检测了乳腺癌组织中TSPAN13基因、蛋白的表达,结果显示,乳腺癌组织中TSPAN13 mRNA及蛋白表达水平均低于正常乳腺组织及乳腺良性肿瘤组织。乳腺浸润性癌是最常见的病理分型,特征为细胞浸润乳腺导管的基底层并侵入间质,乳腺浸润性癌中TSPAN13表达水平低于非浸润癌。本研究结果显示,低分化、有远处转移、Ⅲ期乳腺癌组织TSPAN13低表达,提示TSPAN13可能与乳腺癌的侵袭能力有关。
乳腺癌是一类分子水平具有高度异质性的肿瘤,以分子分型差异为依据对乳腺癌进行分子分型对乳腺癌的个性化治疗意义重大。近年来,乳腺癌分子分型的研究已经从高分子水平深入到基因水平,相关的因子包括ER、PR、HER2、Ki-67蛋白表达等,这些生物学指标与肿瘤的侵袭、转移、复发及预后密切相关[9]。
Ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白质,与恶性肿瘤的进展、转移、复发及预后密切相关[10-11]。Zhang等[12]研究显示,乳腺癌组织中Ki-67高表达,Ki-67表达百分比与增殖程度和转移相关。Ki-67被认为是乳腺癌独立预后指标,是LuminalA和B型分类的关键指标。Cheng等[13]确定以Ki-67指数14%作为预后好、坏的分界。本研究结果显示,Ki-67指数≥14%乳腺癌组织中TSPAN13低表达,提示TSPAN13可能与乳腺癌的转移、预后有关。
ER是存在于乳腺上皮细胞上的一种蛋白质,能与雌激素结合形成复合体,进入细胞核发挥作用[14]。PR是ER作用于染色体后形成的一种蛋白质,可调节乳腺上皮细胞的增殖,PR的合成受ER的调控[15]。ER、PR水平与乳腺癌病人总生存(OS)、无病生存(DFS)、无复发生存(RFS)及5年生存率等呈正相关[16]。本研究结果显示,ER、PR阳性乳腺癌组织中TSPAN13高表达,提示TSPAN13参与了乳腺癌细胞的增殖、分裂等,低表达与乳腺癌预后不良有关。
HER2又称为c-erbB-2基因,编码跨膜受体蛋白,参与细胞生长、分化的信号传导。研究表明,HER2具有抑制细胞凋亡,促进增殖,促进肿瘤血管、淋巴管生成,增强细胞侵袭能力等功能[17]。HER2是评价乳腺癌预后、药物治疗效果的指标之一。研究表明,HER2表达水平与OS、DFS呈负相关。本研究结果显示,HER2阳性乳腺癌组织中TSPAN13低表达,提示TSPAN13可能与乳腺癌预后、临床疗效有关[18]。
本研究入选的样本量较少,有待进一步增加样本量,多中心的研究证实。本次研究未进行相关的生存分析,是我们下一步研究的重点之一。