硝酸铊对斑马鱼胚胎的发育毒性

范力海，张欣彤，侯丽萍

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510655）

铊（Tl）是一种剧毒元素，以一价和三价2种形式存在于环境中。铊广泛存在于水环境中，主要来源于含铊矿石的加工冶炼及工业废水的排放[1]。据报道，我国含铊的铅锌矿床主要分布于广东、甘肃、湖南、云南、陕西等地。有调查显示，河南某家矿产冶炼企业废水中铊的浓度可达361 μg/L[2]。此外，受矿产冶炼影响的农田土壤也存在铊污染的风险。Zhou等[3]对贵州多处受污染村落农田土壤中的铊残留量进行了调查，发现土壤中铊含量最高可达4.97 mg/kg。而且土壤中的铊可经降雨等途径进入水环境或通过污染农作物直接对人造成危害。因此，环境中高浓度铊的存在会对水生生物生存及人类生活生产造成极大的威胁。

最早，铊盐曾用于治疗头藓等疾病，或者用来制作农药及杀鼠剂，由于意外摄入导致了多起人体中毒事件。近10 a，我国发生了多起水环境铊污染事件，例如2010年广东北江河段铊污染事件，2013年广东贺江河段铊污染事件，2017 年嘉陵江铊污染事件等[4]。人体对铊的吸收速度快、途径广，皮肤、呼吸道和胃肠道接触均可引发中毒[5]。铊进入生物体后，可通过干扰钾依赖途径、取代Na+/K+-ATP酶中的钾离子、强烈的亲硫性（与蛋白质或其他生物分子中的巯基具有高亲和力）等多种途径对生物体造成毒害。由此可知，铊是目前已知的毒理作用较为复杂且毒性较为严重的剧毒金属之一[6-7]。

斑马鱼（Danio rerio）是被人们广泛接受并用于胚胎发育、遗传分析、毒理学和多种人类疾病研究的理想模式生物。运用斑马鱼进行毒理试验具备操作简便、成本低、影响因素少并可以监测多种毒性指标等优点[8-9]。笔者以斑马鱼为研究对象，探讨硝酸铊对斑马鱼胚胎发育的不利影响，测定指标包括心率、形态发育、超氧化物歧化酶（SOD, superoxide dismutase）和过氧化氢酶（CAT, catalase）活性及幼鱼行为，以期为评价水环境中铊对生物体的毒性效应提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 AB品系斑马鱼购自上海费曦生物技术有限公司。AB品系成年斑马鱼于水循环养殖系统中雌雄分开养殖至长期稳定，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，每天喂食1～2次丰年虾脱壳卵。胚胎的获取：试验前一晚提前将成年斑马鱼进行避光处理，次日上午（10点后）将成鱼按雌∶雄=2∶1的比例装入孵化盒中，产卵后1 h内收集鱼卵，在解剖镜下挑选正常受精、形状饱满的受精卵用于胚胎毒性试验。

1.1.2 试剂与仪器 主要试剂有三水硝酸铊[纯度≥97.5%，阿法埃莎（中国）化学有限公司]，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。试验用水为曝气自来水，所有暴露液均为每次试验前新配置。主要仪器有体式显微镜及成像系统（Leica MC170 HD，新加坡），酶标分析仪（Rayto RT-6100，中国），高清摄像头（RERVISION RERBXH2MP 0550，中国）。

1.2 试验方法

1.2.1 暴露方法 设置4个硝酸铊暴露浓度，分别为5、50、500、1 000 μg/L，并设置空白对照组（经ICD-MS分析，铊浓度低于0.01 μg/L）。每个浓度组处理32枚胚胎，并设置3个平行组。将正常发育的胚胎随机分装于24孔板（1枚胚胎/孔），每孔加入1.5 mL溶液，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，温度27℃，暴露总时间为168 h，每24 h更换一次溶液，及时吸出死亡的胚胎或幼鱼。

1.2.2 斑马鱼胚胎形态观察及心率记录 进行硝酸铊暴露处理后，使用体视显微镜观察斑马鱼胚胎在发育过程中的形态变化，并使用显微镜摄像系统获取胚胎形态照片与心博视频用于形态观察与心率计数。

1.2.3 胚胎酶活性检测 将胚胎置于离心管中，每处理选取8枚胚胎，去除残余液体，称量后加入一定量的PBS（pH值7.4），用匀浆器将标本匀浆充分。3 000 r/min离心20 min，收集上清，按试剂盒说明书方法测定SOD及CAT酶活性。

1.2.4 幼鱼行为记录 每次试验开始时随机挑选1条暴露168 h的斑马鱼幼鱼放入透明塑料立方盒（2.9 cm×2.9 cm×1.9 cm，盛有16 mL的对应暴露试验溶液）中。立方盒放置在RERVISION高清摄像头镜头下，并调试设备与软件设定（Noldus EthoVision XT 11.5）。用发光板进行白光照射，并阻挡日光。行为测试在同一时间段内进行，且所有试验在3 h内完成。斑马鱼的行为由摄像装置以每秒60帧（fps）、1 280×720像素分辨率进行监测记录。每条斑马鱼放入盒中后，适应1 min后录制5 min的行为活动。斑马鱼幼鱼皆可在盒中自由游动，其游动轨迹被摄像机记录并传入计算机，由 Noldus EthoVision XT 11.5软件记录并分析。区域的划分参考EthoVision XT 操作参考手册（EthoVision XT Reference Manual）：在垂直组中，将立方盒侧剖面正方体区域作为斑马鱼整体活动范围，并在软件中将该区域按三等分划分为上层、过渡层、底层3个区域；在平面组中，将立方盒俯视面正方体作为斑马鱼整体活动范围，并在软件中按2∶1将该区域分为中心区与边缘区。对照组、5 μg/L及50 μg/L TlNO3试验组，各组随机挑取斑马鱼幼鱼10条，记录每条斑马鱼5 min内的移动距离、平均速度与在各区域内的停留时间[10-11]。

1.2.5 统计学分析 使用IBM SPSS Statistics 26统计分析软件分析试验数据，并进行单因素方差分析（oneway ANOVA）、差异显著性分析及t检验。试验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 硝酸铊对斑马鱼心率的影响

由于暴露168 h时1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼数不足以进行统计分析，故选取暴露48、96与156 h时各处理组斑马鱼幼鱼心率进行比较，结果如图1所示。处理48 h后，各组斑马鱼胚胎心率相近，统计学上无显著差异。处理96 h后，50、500及1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼心率与对照组相比显著降低。处理156 h后，50、500和1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼心率与对照组相比显著降低，且下降幅度随着硝酸铊浓度的增加而增大。此外，500、1 000 μg/L TlNO3处理组暴露156 h后斑马鱼幼鱼的心率显著低于暴露96 h时的。

图1 不同暴露时间各处理组斑马鱼的胚胎心率

2.2 硝酸铊对斑马鱼胚胎发育的致畸型毒性

斑马鱼胚胎于受精后72 h进入孵化期，在此之前各试验组胚胎形态无明显区别（图2）；暴露84 h时500和1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼出现孵化延迟或发育阻滞的现象，幼鱼卵黄囊仍膨大，鱼鳔发育慢于对照组；暴露144 h时50、500及1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼出现鱼鳔发育不完全、心囊水肿与脊柱弯曲的现象；暴露168 h时500及1 000 μg/L TlNO3处理组幼鱼脊柱弯曲、心囊水肿现象变的更为明显。

图2 同暴露时间各处理组斑马鱼形态发育的比较

2.3 硝酸铊对斑马鱼SOD酶活的影响

由图3可知，与对照组对比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的SOD活性显著降低；暴露72 h后，1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的SOD活性极显著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的SOD活力分别降低6.7%、12.7%、33.7%、26.7%，其中500、1 000 μg/L TlNO3处理组与对照组差异极显著。

图3 不同暴露时间各处理组斑马鱼胚胎的SOD活性

2.4 硝酸铊对斑马鱼CAT酶活的影响

由图4可知，与对照组对比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的CAT活性显著降低；暴露72 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的CAT活性极显著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼胚胎的CAT活力分别降低13.6%、34.4%、37.3%、57.0%，其中50、500、1 000 μg/L TlNO3处理组与对照组差异显著。

图4 不同暴露时间各处理组斑马鱼胚胎的CAT活性

2.5 硝酸铊暴露对幼鱼行为的影响

此次试验用斑马鱼从受精后即开始进行各浓度TlNO3溶液暴露处理。暴露持续168 h后，500和1 000 μg/L TlNO3处理组斑马鱼几乎全部死亡，对照组与5、50 μg/L TlNO3处理组剩余斑马鱼幼鱼孵化后能够自主活动。

由图5A和D可知，对照组幼鱼在进入新鱼缸后，部分幼鱼长时间在容器壁边小幅度移动，大部分幼鱼能够在一段时间内自主开始探索四周，并在各区域保持较活跃的游动。

与对照组相比，5 μg/L TlNO3处理组幼鱼进入新鱼缸后比较活跃，表现为运动轨迹增多、运动轨迹紊乱（图5B）、游动距离大（图6）、平均速度快（图7）等。该组幼鱼在平面的游动总距离与平均速度远大于对照组与50 μg/L试验组的幼鱼。在水平面上，停留在中心区域的时间占比更多（图5B，图8）；在垂直面上，该组幼鱼更倾向在水底游动，且在游动时难以控制在水中漂浮的深度，具体表现在垂直面上反复下沉上浮（图5E、图9）。

图5 各处理组斑马鱼幼鱼平面及垂直运动的轨迹

图6 0～50 μg/L TlNO3处理组斑马鱼幼鱼平面游动的距离

图7 0～50 μg/L TlNO3处理组斑马鱼幼鱼平面游动的速度

图8 0～50 μg/LTlNO3处理组斑马鱼幼鱼在平面各区域停留的时间

与对照组相比，50 μg/L TlNO3处理组幼鱼转入新鱼缸后出现长时间呆滞不动（图5C）、游动时震颤和小范围内多次摆动头部等现象。在垂直面上，该组幼鱼更倾向于长时间在水面呆滞（图5F、图9），且游动时难以下沉，这与形态观察中暴露组幼鱼的鱼鳔发育不良的结果相吻合。

图9 0～50 μg/LTlNO3处理组斑马鱼幼鱼在垂直各区域停留的时间

以上结果表明，胚胎期和幼鱼早期阶段持续性硝酸铊暴露能够改变幼鱼的行为方式。幼鱼的行为强度变化与环境中铊浓度之间存在倒“U”型的关系，即在168 h内，5 μg/L硝酸铊暴露具有运动兴奋效应，而50 μg/L硝酸铊暴露则表现出抑制幼鱼活动的作用。从胚胎时期开始长时间硝酸铊暴露能够影响斑马鱼胚胎的器官发育，从而损害幼鱼的自发运动能力。

3 讨 论

心率是衡量心脏活动与功能的重要指标之一。受精24 h后，斑马鱼心血管即将形成、心脏即将开始收缩[12]，受精48 h后即可在解剖镜下清晰观察到来自右侧心室和左侧心房的心脏环路，且随着胚胎的不断发育，斑马鱼成鱼的心率能够达到140～180次/min。因此，受精后48 h即可观察斑马鱼胚胎的心跳频率[13]。斑马鱼心脏易受毒物影响[14]，心跳的快慢在一定程度上也可以反映斑马鱼心脏在毒物胁迫下的发育情况与组织器官状况，用于判断硝酸铊对斑马鱼生理发育的影响。

该试验通过对斑马鱼心率的测定，发现暴露48 h时，各处理组斑马鱼胚胎心率差异不大；暴露96 h后，随着斑马鱼幼鱼的发育与孵出，各处理组的斑马鱼幼鱼心率有所加快，但与对照相比，较高浓度的硝酸铊处理使斑马鱼幼鱼心率显著下降；暴露156 h后，斑马鱼幼鱼的心率与硝酸铊处理浓度成反比，即硝酸铊处理浓度越高，斑马鱼幼鱼心率越慢，且500、1 000 μg/L TlNO3处理组暴露156 h后斑马鱼幼鱼的心率显著低于暴露96 h时的。

观察发现，硝酸铊对斑马鱼的致畸型毒性表现为幼鱼发育阻滞、鱼鳔发育迟缓或发育不完全、脊柱弯曲及心囊水肿等。斑马鱼胚胎发生心囊水肿的原因可能有2种，一是水屏障被破坏，一是体内的排水功能异常。鱼类肾脏可以维持机体水和电解质的平衡，而肾脏功能的紊乱则可能导致血液高渗效应，使细胞外的液体排出血管，从而导致水肿的发生[15]。同时，铊离子可以进入胚胎内部，通过损害Na+/K+-ATP酶、干扰蛋白质的合成、扰乱细胞膜内外的离子梯度，造成心囊水肿、脊柱弯曲等组织病变。Long等[16]研究发现，ABCC5在斑马鱼胚胎发育和解除重金属毒性过程中发挥了重要作用。显性失活的ABCC5会引起斑马鱼胚胎发育阻滞，而重金属则可以导致斑马鱼胚胎ABCC5表达上调[17]。

试验结果还表明，硝酸铊处理显著降低了斑马鱼胚胎的SOD和CAT酶活性，破坏了斑马鱼胚胎的抗氧化能力；同时还表现出剂量-效应关系[18]，即硝酸铊浓度越高，SOD及CAT酶活性降低程度越大。SOD是活性氧清除剂，可以将生物经氧化产生的活性氧（ROS）自由基歧化为H2O2和O2，避免ROS对机体的毒害[19]。在低浓度或短时间内，胚胎内SOD活性因重金属胁迫而升高，而在高浓度或长时间的重金属胁迫下，胚胎内SOD活性则被抑制[20]。这些现象表明，硝酸铊处理导致受试斑马鱼胚胎体内·O2-增多，超出了SOD的清除能力，抑制了SOD活性。CAT是过氧化物酶体的标志酶，可催化H2O2分解为O2和H2O，防止H2O2对机体的毒害[19]。该研究中硝酸铊处理对CAT活性同样表现为低浓度或短时间诱导-抑制、高浓度或长时间抑制。以上现象均表明，在硝酸铊处理下，斑马鱼机体清除含氧自由基的机制已严重失衡，因此机体内过多的活性氧可能通过诱导ABCC5表达，从而导致胚胎发育阻滞。

斑马鱼是昼行性动物，在光照下活动，在黑暗中多表现为静止状态[21]。该试验观察了暴露处理168 h后的斑马鱼幼鱼在新鱼缸中的自发活动与行为。此时幼鱼的肌节和心脏、脑、鱼鳔等器官基本形成[22]。与病理损伤、生理生化数据相比，斑马鱼自发行为活动更能直观地反映其整体功能发育。斑马鱼通常在靠近水面位置保持较活跃的游动，但在进入新鱼缸后，通常会长时间待在容器底部、容器边缘保持静止不动，减少探索行为和停留在容器壁附近、水面附近的时间[10]，这表明斑马鱼处在一种高度焦虑的状态下[23]。一段时间后，斑马鱼才会在新鱼缸中开始四处探索[24]，增加鱼缸中心区域停留、运动时间。

在较低浓度的硝酸铊溶液暴露下，斑马鱼表现出较兴奋状态，游动距离长，游动平均速度快，推测低浓度的硝酸铊暴露能影响斑马鱼胚胎的神经系统发育，改变其兴奋抑制功能；而高浓度的硝酸铊严重损害了斑马鱼的组织器官功能，从而使斑马鱼表现为长时间的呆滞与行动迟缓。斑马鱼幼鱼的行为强度变化与环境中硝酸铊浓度之间存在倒“U”型剂量效应关系，在5 μg/L硝酸铊胁迫时斑马鱼幼鱼活动增多、紊乱，游动距离与平均速度增大；50 μg/L硝酸铊暴露使斑马鱼行为出现迟缓、呆滞、活动减少与长时间停留水面现象。故硝酸铊暴露能够影响斑马鱼幼鱼的自发活动行为。较低浓度硝酸铊暴露能使斑马鱼幼鱼表现兴奋状态；较高浓度硝酸铊暴露能使斑马鱼幼鱼表现出迟缓呆滞状态。且硝酸铊处理组幼鱼出现了难以控制在水中位置、下沉困难等现象，这与斑马鱼形态观察结果中幼鱼鱼鳔发育不良的结果相吻合。