BMP2/Smads通路介导富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的作用研究*

孙 琛 朱青青 王佳琼 张 雪

2000年Gronthos［1］等最先从人牙髓组织中分离培养出牙髓干细胞，从此关于牙齿发育、损伤修复及再生机制方面的认知程度进一步加深，并上升到细胞层面。在这一背景下，牙髓干细胞等牙源性干细胞用于体内外组织重建势在必行，这是因为人牙髓干细胞有自我更新、多向分化等潜能，有助于牙髓-牙本质复合体形成［2,3］。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）中的生长因子可诱导多种细胞增殖、分化［4］。体外研究发现，PRF 能够诱导兔半月板细胞增殖，促进细胞外基质合成［5］。已有研究指出PRF 在牙周和软组织修复中起重要作用，但PRF 对人牙髓干细胞成骨分化作用报道少见［6］。本旨在分析PRF 对牙髓干细胞成骨分化的作用及机理，为牙髓干细胞和PRF 的应用提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、血液来源 收集本院20岁左右年轻志愿者，因正畸拔除的健康完整恒牙10 颗，并提取牙髓干细胞，纯化扩增。志愿者均为无吸烟、饮酒史的健康男性，各取静脉血4mL。本研究已经医院伦理学委员会审批。

1.1.2 主要药物与试剂α-MEM 培养基、胎牛血清、胰酶（武汉普诺赛生物公司），反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司），鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC单克隆抗体、兔抗人骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、Runt 相关转录因子2（Runt-related tranion factor 2，RUNX2）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗（日本TaKaRa），BMP 抑制剂LDN-212854、BMP 激活剂山金车内酯C（美国MedChemExpress），碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）试剂盒（上海晶抗生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙髓干细胞培养 用改良组织块-消化联合法培养牙髓干细胞，步骤：取出牙髓，PBS 冲洗2 遍，切成小块，加0.25%胰蛋白酶消化0.5h，离心弃上清，细胞重悬后继续培养。细胞汇合率为80%时传代。

1.2.2 PRF 的制备 按照Li 等［4］的方法制备PRF。取静脉血，1500r/min离心10min（离心半径8cm），分离血浆和血细胞之间白色PRF 凝块，排出多余液体，用2片无菌玻璃片挤压使PRF 凝块形成膜状，渗出液1500r/min 离心10min（离心半径8cm），获得无血细胞的渗出液，用无菌过滤器过滤，储存于-80℃冰箱中待用。

1.2.3 流式细胞仪检测牙髓干细胞表面抗原标记物 取传代培养至第3 代的牙髓干细胞，制成单细胞悬液，PBS 重悬细胞，加鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC，兔抗鼠IgG-APC 为阴性对照，4℃避光孵育1h，重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.2.4 分组及处理 牙髓干细胞随机分为对照组、PRF 组、激活剂组和抑制剂组。对照组牙髓干细胞用含10%胎牛血清的双抗α-MEM 培养基培养；PRF 组在10%胎牛血清的双抗α-MEM 培养基中加入-80 ℃保存的PRF，使PRF 体积分数为50%；激活剂组和抑制剂组在PRF 组培养基基础上分别加入山金车内酯C（终浓度为10μM）和LDN-212854（终浓度为5nM）。

1.2.5 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性检测 取对数生长期的牙髓干细胞，对照组、PRF 组、激活剂组和抑制剂组加入对应的培养基，培养7d、14d 后，加Triton X-100，4℃过夜，细胞完全裂解后加ALP 底物混合液孵育0.5h，0.5mol/L NaOH 终止反应，用酶标仪测定490nm处光密度（A）值。

1.2.6 RT-qPCR 检测人牙髓干细胞成骨分化 标 志 物 胶 原 蛋 白I（collagen-I，COL-I）、RUNX2、骨钙素（osteocalcin，OCN）表达 提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书反转为cDNA，进行荧光定量PCR，2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.2.7 茜素红染色和半定量检测 取对数期的牙髓干细胞，转接到6孔板（1×106个/mL），细胞贴壁后，继续培养至第14d，固定15min，茜素红染液染色，倒置显微镜下观察。半定量检测：晾干固定好的细胞，加1mL茜素红萃取液，在波长562nm外测定A值。

1.2.8 Western-Blot 检 测BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平

取对数期的牙髓干细胞培养14d，收集细胞，提取总蛋白，加入SDS-loading buffer，100℃水浴变性，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，室温封闭2h，一抗孵育过夜，二抗（1∶4000 稀释）室温封闭1h，曝光显影，计算目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 SPSS 24.0 统计学软件分析，计量资料用（±s）表示，符合正态分布，方差齐，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 人牙髓干细胞的表型鉴定 CD29、STRO-1、CD90阳性细胞呈阳性表达，见图1。

图1 牙髓干细胞鉴定

2.2 人牙髓干细胞ALP活性检测PRF组、激活剂组、抑制剂组牙髓干细胞培养7d、14d ALP活性高于对照组（P<0.05）；激活剂组牙髓干细胞培养7d、14d ALP活性高于PRF组，抑制剂组牙髓干细胞培养7d、14d ALP活性低于PRF组（P<0.05）；抑制剂组牙髓干细胞培养7d、14d ALP 活性低于激活剂组（P<0.05）；且随着培养时间增加，对照组、PRF组、激活剂组、抑制剂组ALP活性也在升高（P<0.05）。见表2。

表2 牙髓干细胞ALP活性（±s，n=5）

表2 牙髓干细胞ALP活性（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP<0.05；与PRF组比较，bP<0.05；与激活剂组比较，cP<0.05。与培养7d比较，#P<0.05。

组别对照组PRF组激活剂组抑制剂组F值P值7 d 0.07±0.03 0.23±0.04a0.31±0.04ab0.15±0.03abc14.553<0.001 14 d 0.15±0.03#0.30±0.03a#0.37±0.04ab#0.23±0.03abc#12.214<0.001

2.3 人牙髓干细胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表达 PRF 组、激活剂组、抑制剂组COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表达高于对照组（P<0.05）；激 活 剂 组COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表达高于PRF 组，抑制剂组COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表 达 低 于PRF 组（P<0.05）；抑制剂组COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA表达高于激活剂组（P<0.05）。见表3。

表3 人牙髓干细胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表达水平（±s，n=5）

表3 人牙髓干细胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表达水平（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP<0.05；与PRF组比较，bP<0.05；与激活剂组比较，cP<0.05。

组别对照组PRF组激活剂组抑制剂组F值P值COL-I 0.37±0.06 0.72±0.07a0.91±0.08ab0.53±0.07abc13.222<0.001 RUNX2 0.28±0.05 0.66±0.06a0.87±0.07ab0.47±0.05abc12.876<0.001 OCN 0.46±0.07 1.02±0.09a1.42±0.09ab0.78±0.08abc14.434<0.001

2.4 各组茜素红染色半定量分析结果与红色矿化结节数目比较 与对照组比较，PRF组、激活剂组和抑制剂组红色矿化结节数目增多（P<0.05）；与PRF 组比较，激活剂组红色矿化结节数目增多（P<0.05），抑制剂组红色矿化结节数目减少（P<0.05）；与激活剂组比较，抑制剂组红色矿化结节数目减少（P<0.05）。见图2。

图2 各组矿化结节形成情况比较（茜素红×100）

2.5 各组BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相对表达水平PRF 组、激活剂组和抑制剂组BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相对表达量高于对照组，且抑制剂组

表4 茜素红染色半定量分析结果与红色矿化结节数目（±s，n=5）

表4 茜素红染色半定量分析结果与红色矿化结节数目（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP<0.05；与PRF组比较，bP<0.05；与激活剂组比较，cP<0.05。

组别对照组PRF组激活剂组抑制剂组F值P值A值0.28±0.02 0.66±0.06a1.42±0.09ab0.45±0.03abc389.167<0.001数目15±6 40±8a112±10ab27±9abc134.970<0.001

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相对表达水平（±s，n=5）

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相对表达水平（±s，n=5）

注：与对照组比较，aP<0.05；与PRF组比较，bP<0.05；与激活剂组比较，cP<0.05。

组别对照组PRF组激活剂组抑制剂组F值P值BMP2 0.54±0.07 0.89±0.09a1.18±0.10ab0.39±0.08abc85.760<0.001 Smad1 1.01±0.10 1.02±0.11 1.00±0.10 1.01±0.10 0.158 0.878 Smad5 1.21±0.12 1.20±0.12 1.19±0.12 1.20±0.12 0.316 0.760 p-Smad1/5 0.35±0.06 0.68±0.07a0.91±0.09ab0.22±0.07abc91.473<0.001 RUNX2 0.29±0.04 0.70±0.08a0.90±0.09ab0.13±0.02abc153.899<0.001

图3 BMP2、Smad1、Smad5、RUNX2蛋白相对表达水平

3.讨论

Ferrarotti等［7］、Li等［8］、Fuji等［9］研究表明，在一定环境下，牙髓干细胞可凭借类似骨髓基质干细胞的多向分化潜能，分化为骨、肌肉等组织细胞。PRF富含多种与组织修复相关的生长因子，在牙周和软组织修复中也起重要作用，因此研究PRF对牙髓干细胞成骨分化的作用对口腔科学的发展至关重要［10,11］。

CD29、STRO-1、CD90能促进干细胞增殖［12］。本研究中，STRO-1、CD29、CD90阳性表达，表明本研究分离培养的牙髓干细胞符合其表型。ALP反映成骨细胞分化程度，并能促进骨基质矿化形成［13,14］。Matsui等［15］研究表明，干细胞分化程度与ALP活性成正比。有研究发现，使用根尖乳头干细胞内加入PRF后，ALP等成骨标志物表达明显上调［16］。本研究中PRF组与对照组比较，ALP活性明显升高，矿化结节数目增多，提示PRF可诱导成骨细胞分化。黄奕智等［17］发现用PRF处理牙周膜成纤维细胞，对细胞增殖、成骨细胞分化均有诱导作用。COL-Ⅰ、RUNX2、OCN可谓人牙髓干细胞的成骨分化标志物，本研究中，与对照组比较，PRF组人牙髓干细胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN表达明显升高，提示PRF可促进人牙髓干细胞成骨分化。

BMP是调控生长发育过程中扮演重要角色的转化生长因子-β1超家族成员。膜表面的BMP配体结合BMP Ⅰ型和Ⅱ型受体，受体活化后启动Smad依赖型信号通路，诱导RUNX2 在细胞核内高表达［18,19］。本研究结果提示BMPR2 抑制剂可下调BMPR2-pSmad1/5-RUNX2信号通路，诱导去分化软骨肉瘤细胞凋亡［20］。本研究中PRF组相较于对照组BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 表达明显升高，但PRF组BMP2、p-Smad1/5、RUNX2表达低于激活剂组又高于抑制剂组，提示PRF是通过激活BMP受体的表达，促进Smad1/5磷酸化，诱导RUNX2表达发挥作用，从而促进牙髓干细胞向成骨分化。

综上所述，PRF 可能通过激活BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成骨分化，为口腔科学临床研究奠定基础。