碱酸处理钛基钽涂层对兔骨髓间充质干细胞生物学活性的影响*

崔建通 母晓丹 黄 萌 黑俊皓 贺慧霞

金属钽由于其优异的抗腐蚀性和生物相容性，正愈来愈多的应用于人工关节和椎间植入物，展示出较为理想的骨结合特性，并在口腔人工种植牙领域广受关注，而钽表面活性是医学领域关注的焦点［1,2］。已有研究表明钽涂层表面容易形成稳定且惰性的五氧化二钽层，影响其与细胞和组织的结合，因此进一步活化钽涂层表面，赋予其表面生物活性是必要的［3］。其中NaOH碱溶液处理可提升金属钛钽表面生物活性，能够在其表面形成弱碱性的生物活性涂层，可以加速模拟体液中离子在其表面上的自发成核，从而促进类骨质结构的形成，进而调节细胞的生物学功能［3］。有研究发现钛片经NaOH处理后，表面可形成弱碱性生物钛酸盐涂层，再经低浓度0.5mmol/L HCl酸处理后去除其表面的钠离子，有助于进一步增强钛种植体的生物活性［4,5］，而钽涂层经碱酸处理后表面形貌、成分变化以及对细胞功能的影响尚未见报道。

本研究是在前期等离子喷涂制备钛基钽涂层的基础上，进一步研究碱和酸处理后涂层表面理化特性变化及其对兔骨髓间充质干细胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs）生物学活性的影响，以提高钛钽人工种植体的骨结合，为推动钛钽人工种植体临床转化研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1 材料与分组 主要材料、试剂和设备：钛基钽涂层片（华南理工大学提供）规格：厚度1mm，直径分为5mm、10mm两种，钽涂层厚度约120μm，采用真空等离子喷涂（VPS）技术制备。新西兰兔（解放军总医院动物中心购买），胎牛血清（四季青，中国），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国），低糖DMEM培养基（Gibco，美国），牛血清白蛋白（Sigma，美国)，CCK-8（碧云天，北京），细胞总RNA提取试剂盒（索莱宝，北京），逆转录聚合酶链式反应试剂盒（Novoprotein，上海），BCIP/NBT碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）显色试剂盒（碧云天，北京）。场发射枪扫描电子显微镜（Zeiss Merlin SEM，英国），能量色散X射线光谱仪（EDS，Oxford Instruments，英国），酶标仪（TECAN infinite M200pro，瑞士），荧光显微镜（尼康，日本），PCR扩增仪（Bio-RadCFX96，美国）。

实验分组如下：钛基钽涂层片为（Ta）组:未做特殊处理；酸处理（HCl）组:钽涂层片浸入0.5mmol/L HCl 0.5h；碱处理（NaOH）组：钽涂层片浸入60℃0.5mol/L NaOH 24h；碱酸依次处理（NaH）组：先浸入60℃0.5mol/L NaOH 24h 后再浸入0.5mmol/L HCl 0.5h。其中NaOH和HCl浓度建立依据课题组前期研究基础及参考相关文献［6-8］，各组处理后去离子水震荡清洗20min，Co60消毒灭菌备用。

1.2 材料表面表征 分组同上，各组试件经丙酮，无水乙醇，去离子水各震荡清洗20min，彻底烘干后，场发射枪扫描电子显微镜（Zeiss Merlin SEM，英国）在5KV电压下观察试件表面形态，并通过配套能量色散X射线光谱仪（EDS，Oxford Instruments，英国）对涂层表面100平方微米区域相关元素进行分析。

1.3 材料表面蛋白质吸附试验 牛血清白蛋白（Sigma，美国）加去离子水配置成2mg/ml溶液。将10mm直径钽涂层片按上述分组分别置于48孔板中，每组4个复孔。然后将配好的200μl蛋白溶液加载到每个样品涂层表面，37℃孵育2h，依次转移至新的24孔板中，PBS洗3次，加200μl 2% 十二烷基硫酸钠（Sigma，美国）振荡孵育2h，经酶标仪（TECANinfiniteM200pro，瑞士）检测波长562nm处的OD值。采用BCA蛋白质检测试剂盒（碧云天，中国)，根据标准曲线计算每个样品上吸附的蛋白总量。

1.4 rBMSCs培养扩增 细胞来源于兔骨髓原代培养，所用动物新西兰大白兔12只，经解放军总医院动物中心购买，通过院伦理委员会审批（批准号：2021-x17-13）。取2周龄新西兰兔股骨，采用全骨髓贴壁法获取rBMSCs。主要步骤如下：无菌条件下,咬骨钳去除股骨两端皮质,采用加青霉素/链霉素的低糖DMEM培养基冲洗骨髓腔，收集后以1000转/分钟离心5min，取下层沉淀物，用含20%胎牛血清，100mg/L链霉素和100U/mL青霉素的低糖DMEM培养基重悬，移至孵箱（5% CO2、37℃）中培养。细胞生长达培养皿底面积80%～85%时，用0.25% 胰蛋白酶消化、传代备用。成脂诱导时细胞培养在含胎牛血清（10%）、IBXM（0.5mmol/L）、地塞米松（0.1μmol/L）、吲哚美辛（100μmol/L）、胰岛素（10μmol/L）、青霉素（100U/mL）和链霉素（100mg/L）的DMEM培养基。成骨诱导时细胞培养在含胎牛血清（10%）、维生素C（50μg/ml）、β-甘油磷酸钠（20mmol/L）、地塞米松（100nmol/L）、青霉素（100U/mL）和链霉素（100mg/L）的DMEM培养基。细胞以3×105个/mL密度接种在6孔板，生长至孔板底面积约85% 时进行成脂诱导、成骨诱导；每3d换液，诱导14d、21d分别进行油红O和茜素红染色观察。

1.5 免疫荧光检测材料表面rBMSCs黏附 取第2代rBMSCs以5×104个/孔分别接种在直径10mm的不同处理的各组钽涂层钛片表面，置孵箱培养4h，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，按照说明书采用罗丹明标记的鬼笔环肽（索莱宝，北京）和DAPI（碧云天，北京）免疫荧光染色，荧光显微镜（尼康，日本）观察细胞在各组材料表面的黏附情况。

1.6 CCK-8检测rBMSCs在材料表面增殖 按照前述分组，将直径5mm各处理组材料置于96孔板，将第2代rBMSCs以3×103个/孔接种在材料表面，按照CCK-8说明书操作，分别在1d、3d、5d加入CCK-8工作液（培养基：CCK-8=10∶1）孵育1h，酶标仪检测波长为450nm处的OD值。

1.7 ALP、茜素红检测rBMSCs在材料表面成骨分化 取第2代rBMSCs以2×104个/孔密度接种在不同处理的4组钽涂层表面，24h后进行成骨诱导，每3d换液。成骨诱导14d后按照BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天，北京）进行ALP染色。诱导21d，PBS冲洗后经4%多聚甲醛固定30min，随后每孔加入1mL茜素红染液染色10min。再次经PBS冲洗后，观察各组染色情况。

1.8 RT-qPCR检测rBMSCs在材料表面成骨相关基因表达 取第2代rBMSCs以5×104个/孔的密度接种在直径10mm的4组材料表面，每组5个样本，细胞生长达80%后同前方法成骨诱导。在第4和7天收集材料表面生长的细胞，取细胞内RNA，测定其浓度并反转录获得cDNA,配置20μl反应体系，按照95℃预变性1min，而后95℃20s，60℃1min循环40次进行PCR反应,从而测定成骨相关基因Runx2和COL-I的表达水平。GAPDH作内参，引物如表1所示。

1.9 统计分析 实验数据均以平均值±标准差表示。本研究使用GraphPad Prism 7软件对结果采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和随机区组设计的两因素方差分析（Two-way ANOVA）进行统计分析，P<0.05表示有显著性差异。

2.结果

2.1 材料表面理化及生物特性分析SEM显示不同处理组表面形态略有不同（图1）。各组钽涂层呈现粗糙的表面结构，SEM和EDS显示HCl组涂层表面形貌和元素组成未见明显改变。高倍镜下NaOH组涂层相对更加致密，而NaH组涂层呈现出大小不等的孔隙结构。能谱仪检测各组材料表面成分结果显示各组表面的元素成分相似，NaOH组表面沉积大量的钠元素，而NaH表面钠元素明显减少（图2）。血清白蛋白吸附实验结果显示Ta组、HCl组和NaOH组之间的血清白蛋白吸附能力无显著差异（P>0.05），NaH组血清白蛋白吸附多于其它组（P<0.05）（图3）。

图2 EDS分析各钽涂层表面元素组成A:Ta;B:HCL组;C:NaOH组;D:NaH组

图3 血清白蛋白加载2h在不同钽涂层表面的吸附情况*代表与Ta组比较P<0.05，其余与Ta组无差异

2.2 rBMSCs 鉴定rBMSCs 形态呈典型的长梭形，如图4A 所示。油红O 染色可见细胞内出现红色脂滴，如图4B 所示。茜素红染色结果显示rBMSCs 经成骨诱导后可形成矿化结节，如图4C所示。

图4 rBMSCs培养与鉴定A:第2代细胞形态;B:14d油红O染色;C:21d茜素红染色（标尺100μm）

2.3 细胞在材料表面黏附和增殖 细胞接种在4 组材料表面，经罗丹明标记鬼笔环肽染色的细胞骨架结构呈现红色，而胞核经DAPI 标记呈蓝色荧光。细胞接种在钽涂层表面均展示出良好的伸展状态。但细胞在不同钽涂层处理组表面黏附有所不同，其中在NaOH 组和NaH 组细胞黏附明显较多（图5）。进一步CCK-8 检测细胞在四组材料表面增殖结果如图6所示，各组间第1d增殖无差异（P>0.05）, 第3d、5d NaOH 组和NaH 组较Ta 组和HCl组细胞增殖显著增加（P<0.05）。

图5 细胞在不同处理组涂层表面黏附情况，细胞骨架为罗丹明标记鬼笔环肽染色，细胞核为DAPI染色（标尺100μm）

图6 CCK-8检测细胞在不同钽涂层表面增殖情况**代表与Ta组比较P<0.01，#代表与NaOH组比较P<0.05

2.4 ALP染色及茜素红染色 第2代rBMSCs接种在材料表面14d，ALP染色结果如图7所示，与Ta组和HCl组相比，NaOH组和NaH组出现明显的蓝色或灰黑色的ALP染色颗粒，其中NaH组的着色颗粒明显多于NaOH组。第2代rBMSCs接种21d，各组材料表面茜素红染色结果如图8所示，与Ta组和HCl组相比，NaOH组和NaH组均有红染的钙化结节，其中NaH组钙化结节比NaOH组呈现出更深染的红色。

图7 成骨诱导14d各涂层表面ALP染色情况A:钽涂层;B:HCl组;C:NaOH组;D:NaH组

图8 成骨诱导21d各涂层表面茜素红染色情况A:Ta;B:HCl组;C:NaOH组;D:NaH组

2.5 RT-qPCR 检测rBMSCs 在材料表面成骨相关基因表达 接种rBMSCs 于材料表面4d 和7d 后的成骨相关基因表达结果如图9 所示。Ta 组和HCl 组Runx2、COL-I 基因表达无显著差异（P>0.05）。而NaOH 组和NaH 组这两种基因的表达水平均明显高于另两组（P<0.05），与NaOH 组相比，NaH 组Runx2、COL-I基因的表达水平更高（P<0.05）。

图9 各组rBMSCs 成骨分化相关基因的表达情况（*代表与Ta组比较，*P<0.05,**P<0.01）

3.讨论

钽金属因其优异的抗腐蚀性能以及良好的生物活性受到越来越多的关注，已在人工种植牙领域广为研究，其中在钛种植体表面建立钽涂层以增加其生物活性和抗腐蚀性、发挥更好促进骨结合性能成为种植体表面改性研究热点之一［9］。而种植体表面形貌和化学成分是影响种植体骨结合的两个重要特性［10,11］。研究证明，碱酸处理能使钛种植体表面发生化学改变并改善其表面形貌特征，从而提高其生物活性，诱导成骨发生［12,13］。但碱酸处理对金属钽表面形貌与化学成分及其生物活性有何影响，目前研究不多，而钽经等离子喷涂制备成钛基钽涂层后再碱酸处理，对其表面特性有何影响尚未见报道。

前期研究表明，NaOH 处理金属钛或钽能够提升钛或钽的生物活性，可在表面形成稳定的无定形或晶态的弱碱性钛酸盐或钽酸盐混合物，通过离子交换吸引钙磷离子，有效提升其在模拟体液中的成核能力，促进表面羟基磷灰石的形成，促进细胞在其表面的黏附增殖［14］。然而Fawzy 等研究发现钛种植体经10mol/L NaOH 处理后，再经0.5mmol/L HCl处理去除其表面钠离子能够促进其表面磷灰石的形成，促进成骨效果更佳，将钛人工种植体植入兔胫骨2 周后推出实验发现碱酸依次处理组的骨界面抗剪切力为单纯碱处理组的1.5倍［6］。本实验也发现rBMSCs在碱和碱酸次序处理后的钽涂层呈现出较强的黏附水平，而细胞黏附是人工种植体表面与组织细胞反应的第一步，在骨整合中起着关键作用，增加种植体表面的细胞黏附继而促进细胞生长分化和骨结合至关重要。本研究CCK-8 实验也证实，碱酸各处理组对细胞增殖的影响也随培养时间延长而增加，细胞接种在材料表面1d、3d、5d NaOH 组和NaH 处理组细胞增殖速度增加，这提示碱和碱酸处理后在其表面可能形成了具有一定生物活性的钽酸盐涂层，促进了细胞的黏附和增殖。此外实验还发现碱处理后继而酸处理的涂层表面不仅钠元素明显减少，而且对带负电荷的蛋白吸附增多，推测碱处理后再HCl酸处理在去除钠元素的同时改变了钽涂层表面的电势能和电荷性质，使其带部分正电荷。由于血清白蛋白能为细胞附着提供结构框架发挥重要作用［15,16］，推测电荷改变同样有利于细胞黏附，而后续各组材料表面电势能及电荷变化有待于进一步研究明确。

种植体表面微纳米级粗糙结构能够有效增加材料与骨的接触面积，为细胞的黏附生长提供有利的微环境，利于细胞外基质的形成［17,18］。在众多种植体表面形貌改性方法中，酸碱处理被认为是一种简单有效的改性方法，可在钛、钽表面形微纳米孔隙结构，提高其亲水性及生物活性，有助于成骨细胞在其表面黏附生长以及进一步促进骨结合［19,20］。本实验中，0.5mol/L NaOH 处理后，钽涂层表面的孔隙增加，与Ta 组和HCl 组比较，rBMSCs 在NaOH 处理的涂层上表现出更强的黏附增殖能力，这也验证了微米形貌的变化对细胞黏附增殖的促进作用。不仅如此，Camargo 等［8］将喷砂后的钛种植体浸入60℃的5mol/L NaOH 溶液处理24h，SEM 显示其表面形貌发生亚微米级（200nm）结构的改变，体外实验发现碱处理促进了其在模拟体液中的成核反应。进一步将种植体植入大鼠胫骨8周, 与未处理组骨结合率50.6±15.3%相比，碱处理组种植体骨结合率提升至62.0±15.0%。同样，Miyazaki 等［7］发现0.5mol/L NaOH 处理钽片后表面形成的缝隙样形态更利于羟基磷灰石的形成，表现出更优异的生物活性。需要指出的是：钽金属具有较强的抗腐蚀性能和耐酸性能，低浓度0.5mol/L NaOH 和0.5mmol/L HCl处理既避免产生涂层降解、影响涂层与基体的结合、离子释放和腐蚀产物导致细胞凋亡等问题，又使涂层表面形成的孔隙相对均匀，增加了rBMSCs 在其表面黏附和增殖，提升了钽涂层表面的生物活性。

现已明确骨组织形成过程的关键步骤包括细胞增殖、成骨分化、胞外基质分泌以及基质矿化［21］。ALP是骨形成过程中成骨细胞的标志性活性酶，而钙结节的形成大小和多少可直观反映细胞成骨分化的矿化程度［22］。本实验发现碱酸次序处理后钽涂层表面细胞内ALP 形成更多的深染蓝色沉淀，茜素红染色也显示出更多成砖红色染色的细胞基质矿化结节，提示碱酸次序处理后表面矿化程度更高，更能有效诱导细胞的成骨分化。成骨相关基因的表达水平是基因水平检测成骨细胞分化的关键指标，本研究中对生长在不同材料表面细胞的成骨相关基因Runx2 和COL-I 的表达分析发现，与Ta组和HCl 组比较，NaOH 和NaH 组细胞在材料表面培养4d 和7d，其Runx2和COL-I等基因表达均显著升高，而后者较前者升高更明显。Runx2 是早期阶段表达、成骨细胞分化所必需的转录因子［23,24］；COL-I 则是成骨细胞早期骨向分化的标志性蛋白，也是骨基质的主要成分和矿化物形成所必需的核心，参与骨组织基质形成和矿化［25］。可见细胞在材料表面黏附、增殖后在第4d 即开始向成骨分化，也进一步证实了碱酸处理后的钽涂层的成骨诱导潜能，提示材料表面形貌和化学成分改变有效的刺激了rBMSCs 向成骨细胞分化，使其表达成骨相关基因并形成矿化基质和无机物沉积。

本实验通过碱酸次序处理成功改变了钛基钽涂层表面的化学成分和形貌，有效促进了蛋白吸附，促进了细胞在涂层表面的黏附、增殖以及成骨分化，证明该法是一种简单、有效的钽涂层表面改性方法，可用于钛基钽涂层人工种植体的表面处理，为其临床转化研究奠定基础。然而目前酸碱处理方法众多，尚无统一的处理方法，对于钽涂层的处理尚需进一步实验探索包括酸碱浓度、处理温度、制备气压等最佳处理参数，在使涂层达到最佳生物活性的同时不损害涂层的结合强度。此外其在体内的骨诱导作用及骨形成能力也仍需进一步实验验证。