补肾健脾方干预大鼠成骨细胞增殖和凋亡的实验研究

鲍荣华 周虹 李旭云 孔令成

细胞衰老的过程是内质网应激反应持续的过程。内质网通过激活非折叠蛋白反应以保护由应激所引起的细胞损伤，减轻内质网负担，恢复细胞功能，但如果应激刺激过于强烈、持久，内环境紊乱无法纠正，则相应凋亡机制被激活并诱导细胞发生凋亡。成骨细胞作为骨质疏松症发生的关键细胞，它不仅参与骨形成，而且还参与破骨细胞性骨吸收的调节，因此笔者认为调控成骨细胞内质网的应激反应，对防治骨质疏松症有重要的意义。目前的研究[1-2]已证明补肾中药复方对骨代谢既可抑制骨吸收，又可促进骨形成，缩短再造周期，提高骨生物力学性能，改善骨质量。本院根据右归饮(《景岳全书》)加减化裁而来的补肾健脾方，在临床实践中具有较好的治疗骨质疏松症的作用。但其对成骨细胞的作用机制不明确，为了弄清该方对大鼠成骨细胞凋亡的影响及其作用机制，本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应法，检测Caspase-3、Bax、ERO1和Bcl-2的表达量，并分析三者的关系，为研究中药复方治疗骨质疏松症提供客观量化的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6月龄SD大鼠15只，雌性，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号44005800010719。

1.2 实验药物及试剂

补肾健脾方由肉苁蓉、菟丝子、淫羊藿等10味中草药组成，据临床用药剂量及新药研究中动物用药剂量要求，该方的提取药物，含生药量1.65 g/mL。阿仑膦酸钠片，由默沙东公司提供(国药准字J20080073，批号为H20130241)。DMEM培养基(Lot1896968)、胎牛血清(FBS；Lot1755919)、Ⅱ型胶原蛋白酶(Lot1934492)、胰蛋白酶溶液(Trypsin；Lot1851925)来自澳大利亚Thermo Fisher公司。青霉素和链霉素(P/S；Lot076M4762V)来自美国Sigma-aldrich公司。Trizol裂解液(Lot180506)来自美国Thermo Fisher公司。RNA提取试剂盒(Cat9767)来自美国Takara生物有限公司。Oligo-dT等RNA逆转录试剂、PCR反应试剂盒(Lot0000256582)、Tetrazolium salt (Lotab146310)来自澳大利亚Promega公司。

1.3 方法

1.3.1动物分组、干预及取样 15只SD大鼠，随机分为补肾健脾方组、阿伦膦酸钠组、空白对照组(等体积生理盐水)，每组5只。按照人-大鼠体表面积比值折算大鼠等效给药剂量，计算得出补肾健脾方组给药浓度为5 mg/kg，阿伦膦酸钠组给药浓度为1 mg/kg，空白对照组给予同等体积的生理盐水。1次/d，连续12 d，最后一次给药后1 h处死，各组动物在1%水合氯醛3 mL/kg麻醉下，无菌条件下腹主动脉采血，4 ℃冰箱静置待全血凝固后(约4 h)，3 500 r/min离心15 min，取上清。同组混合，56 ℃灭活30 min，用0.22 μm 针头微孔滤器过滤除菌，-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2大鼠成骨细胞的提取、培养及成骨分化 将2只新生24 h内的SD大鼠脱颈处死，在70%酒精中浸泡5～10 min，无菌环境下取大鼠颅骨，在D-Hanks平衡溶液中去除附着在骨表面的血管及结缔组织，将颅骨剪碎，并在无血清的DMEM中用1 mg/mL胶原胰酶消化在37 ℃细胞培养箱中消化5次，分别持续30 min(第1组分)，25 min(第2组分)，25 min(第3组分)，20 min(第4组分)和15 min(第5组分)。将第1组分和第2组分混合，第3，4，5组分混合，150 r/min离心10 min，用D-Hanks液洗涤两次，重悬细胞于DMEM完全培养基中(含10% 胎牛血清，1%双抗)，将细胞接种于细胞培养瓶，置于37 ℃，5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。48 h换液，弃去悬浮细胞，每隔2 d换液1次。待细胞融合率达到90%以上时，加入成骨诱导培养基培养。成骨诱导培养基各成分比例为 100 nmol/L的地塞米松，50 μg/mL的维生素C膦酸酯，10 mmol/L的β-甘油膦酸钠。

1.3.3MTS检测补肾健脾方对大鼠成骨细胞毒性的影响 根据MTS试剂盒测定补肾健脾方对大鼠成骨细胞的影响。将成骨细胞以3 000个细胞/孔接种在96孔板上并过夜。后将(0.0，0.1，0.5，1.0，2.5， 5.0 μmol/L)的大鼠补肾健脾方含药血清加入成骨细胞一起孵育48 h和72 h，再将试剂10 μL加入96孔中，在酶标仪上于490 nm波长处测定各孔吸光度。

1.3.4qRT-PCR实验 将成骨细胞按每孔5×104个细胞的密度种入6孔板中，长至80%时则更换成骨诱导培养基，加入大鼠补肾健脾方含药血清，大鼠阿伦膦酸钠含药血清，空白对照组加入相应体积的PBS。每2 d更换1次培养基或分化液，至第7天使用PBS清洗各组细胞1次，随后进行qRT-PCR实验。每孔加入1 mL Trizol裂解液，冰上裂解20 min，加入200 μL氯仿，充分混匀，室温放置10 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清水相，转至新的EP管中，随后使用RNA提取试剂盒提取细胞RNA，操作流程参照试剂盒使用说明。以Oligo-dT等试剂为反转录引物，以提取的总RNA为模版，在酶的催化下特异反转录为cDNA。RT-PCR采用SYBR Green和表1的特定引物。反应条件：预变性95 ℃ 10 s，变性95 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 31 s，共40个循环。每个样本设置3个复孔，并采用2-△△Ct法进行定量分析。RNA相对表达量参照内参基因Hprt。

表1 qRT-PCR实验引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 MTS细胞毒性检测

细胞毒性的检测结果表明，补肾健脾复方含药血清(0.0，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0 μmol/L)在48 h和72 h对成骨细胞未见明显毒性作用(见图1)，差异不明显，无统计学意义。

图1 补肾健脾复方中药MTS毒性实验结果

2.2 补肾健脾方含药血清抑制成骨细胞凋亡的基因表达

通过qRT-PCR检测，发现相比于空白对照组，补肾健脾方含药血清组和阿仑膦酸钠含药血清组均能明显降低大鼠成骨细胞中Caspase-3和Bax基因表达的水平，提高Bcl-2基因表达的水平(见表2)，其中阿仑膦酸钠含药血清组抑制大鼠成骨细胞凋亡基因表达比补肾健脾方含药血清组强。而ERO1在各组的变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 补肾健脾方组和阿仑膦酸钠组对大鼠成骨细胞凋亡基因表达的影响

3 讨论

骨质疏松症可能导致严重的骨折和残疾，并与年龄密切相关，但任何原因所致的峰值骨量(BMD)下降、骨吸收增加和形成不足都可引起骨量降低和股脆性增加[3-4]。越来越多的证据表明，破骨细胞和成骨细胞在骨形成和骨吸收过程中的不平衡是导致骨质疏松症的重要原因[5-6]。值得注意的是，骨形成依赖于成骨细胞的增殖和分化，李淑梅等[7]研究表明淫羊藿甙能提高成骨细胞中ALP和ColⅠmRNA的表达水平，从而促进成骨细胞增殖与分化，并通过提高BMP-2的表达水平来促进成骨细胞Osterix的基因表达，从而诱导骨形成，发挥抗骨质疏松作用。现代医学证实诱导成骨细胞的凋亡会进一步导致骨破坏[8]。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶，该酶属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，是六大蛋白酶家族之一[9]。BCL-2蛋白家族控制细胞凋亡的内在途径，BAX的活性受到BCL-2家族内外复杂蛋白网络的精确控制。Bax通过渗透线粒体外膜和随后启动Caspase级联，使细胞进入程序性死亡[10]。ERO1主要参与维持 ERS内氧化状态，ERO1激活过多就会导致是细胞内活性氧簇(ROS)的增多，从而诱导细胞的凋亡加速。

中医认为“肾藏精，生髓，主骨”，是肾中精气促进机体生长发育功能的具体体现，骨的生长发育依赖肾中精气的滋养与推动，肾中精气充盈则骨髓生化有源，骨才能得到髓之滋养[11]。并认为骨质疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的过程，且在“肾主骨”理论的指导下进行组方用药。因此，补肾中药已被用作治疗骨质疏松症的常用药物，有研究[12-13]证明以“补肾健脾法”拟定的补肾健脾方对骨代谢有双向作用，既可抑制骨吸收，又可促进骨形成，缩短再造周期，提高骨生物力学性能，改善骨的质量，是一个较理想的治疗骨质疏松症的药物。林巧璇等[14]观察补肾活血汤对骨质疏松性椎体压缩性骨折(OVCF)经皮椎体后凸成形术(PKP)后患者疼痛和血清骨代谢的改善作用，认为补肾活血汤能缓解OVCF术后患者疼痛，提高日常生活能力，促进骨形成，减少骨吸收，增加骨密度，可能降低OVCF术后患者再发骨折的风险。秦梦等[15]观察右归丸、淫羊藿、淫羊藿苷含药血清对成骨细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路的作用，发现右归丸、淫羊藿、淫羊藿苷三者均能促进体外培养的大鼠成骨细胞的增殖，以右归丸作用最显著；右归丸可显著促进wnt3a、wnt7b、β-catenin蛋白的表达。而本研究中的中药复方是根据右归饮加减化裁而来，方中由肉苁蓉、菟丝子、淫羊藿等10味中草药组成，该方从骨质疏松症的肾虚、脾虚等病因病机立法，全方诸药共奏补肾壮骨、健脾益气、活血化瘀之功效。经过临床的实践应用，认为对骨质疏松症具有较好的治疗作用，然而，该方对成骨细胞的影响及其作为治疗骨质疏松症的新化合物的潜力还有待进一步研究。

在本研究中，数据显示补肾健脾方能显著下调Bax基因的表达，降低Caspase-3的活性，而Bcl-2的表达在大鼠成骨细胞中上调。但是ERO1的表达不显著，笔者分析有可能补肾健脾方没有通过由ERO1所介导的内质网途径，而对Caspase-3和Bcl-2的表达显著，有可能是通过Caspases途径进行细胞凋亡的调控。基于上述结果，笔者认为补肾健脾方减少大鼠成骨细胞的凋亡，而且是通过Caspase-3/Bcl-2途径进行调控。而且本实验利用MTS法，通过观察补肾健脾方对大鼠成骨细胞活性的影响，证实补肾健脾方对大鼠成骨细胞无毒性作用。

综上所述，补肾健脾方可在一定程度上抑制大鼠成骨细胞的凋亡，而且是通过Caspase-3/Bcl-2途径进行调控，是治疗骨质疏松症的潜在靶向药物。