高效液相色谱法测定酱菜中脱氢乙酸含量的不确定度评定
2021-10-15邢蕊胡宗武梁笑天董蔚漆倩涯
邢蕊，胡宗武，梁笑天，董蔚，漆倩涯
(1.兰州中检科测试技术有限公司，兰州 730070；2.兰州理工大学 石油化工学院，兰州 730050)
酱菜是将新鲜的蔬菜经腌渍、微生物发酵或酱渍加工而成的各种蔬菜制品[1]，因味道鲜美、营养丰富而深受人们的喜爱，逐渐成为人们饭桌上不可或缺的调味副食品[2-3]。脱氢乙酸是一种低毒高效的食品防腐剂[4-5]，常用于面包、糕点、果蔬汁、发酵豆制品、腌渍的蔬菜等食品中[6]。但是大量地使用脱氢乙酸将会影响人体的肾脏、肝脏[7]，甚至可能引发癌症[8]，同时GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[9]中也明确指出了脱氢乙酸在一些食品中的最大使用量，其中在腌渍的蔬菜中脱氢乙酸的最大使用量为1.0 g/kg[10]。因此，我们对食品中脱氢乙酸的使用进行日常监管及对检测结果的准确性判断显得尤为重要[11]。
本实验依据GB 5009.121-2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》[12]、JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[13]和CNAS-GL006-2019《化学分析中不确定度的评估指南》[14]中规定的基本方法和程序，采用高效液相色谱法对酱菜中脱氢乙酸的含量进行了测定，分析酱菜中脱氢乙酸含量的不确定度来源，并对其测定结果的不确定度进行了计算和评定，从而为酱菜中脱氢乙酸含量测定方法的可行性和准确性提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱菜：市售；脱氢乙酸标准品：批号B0003452，纯度99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸铵：色谱纯，Aladdin公司；甲醇：色谱纯：HiPure Chem公司；硫酸锌和氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器) 日本岛津公司；ME204E电子天平 梅特勒-托利多公司；KQ-500DE超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；LD5-2B离心机 北京雷勃尔离心机有限公司。
1.3 实验方法
参照GB 5009.121-2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》第二法液相色谱法。
1.3.1 标准溶液配制
准确称取脱氢乙酸标准品10 mg，用1 mL氢氧化钠溶液(20 g/L)溶解在10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1000 μg/mL浓度的标准贮备液。分别吸取脱氢乙酸贮备液0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的标准工作液。
1.3.2 样品前处理
称取已粉碎的试样2 g，置于50 mL离心管中，加入约10 mL水、5 mL硫酸锌溶液(120 g/L)，用氢氧化钠溶液(20 g/L)调pH至7.5，转移至25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10 min，4000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。
1.3.3 色谱条件
色谱柱 ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (4.6 mm×250 mm×5.0 μm)；柱温：30 ℃；流动相：甲醇+0.02 mol/L乙酸铵溶液(10+90，体积比)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：293 nm。
1.4 数学模型的建立
样品中脱氢乙酸含量的计算公式为：
式中：X为样品中脱氢乙酸的含量，g/kg；C为样品溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；C0为空白样品溶液中脱氢乙酸的质量浓度，μg/mL；V为样品溶液总体积，mL；m为样品的质量，g。
2 结果与分析
2.1 不确定度来源分析
根据实验方法所建立的数学模型并结合相关信息，分析影响测定结果的不确定度，其主要来源于样品的称量、样品溶液的定容、标准溶液的配制、容量瓶的校准、标准曲线的拟合、样品的重复性分析等过程。
通过分析以上各不确定度分量，并合成相对标准不确定度。在95%的置信水平下，得到扩展不确定度，最终量化高效液相色谱法测定酱菜中脱氢乙酸含量的不确定度。
2.2 不确定度各分量的评定
2.2.1 样品称量过程中引入的不确定度
称量过程的重复性和天平的准确性是样品称量过程中不确定度的主要来源，其中样品称量过程中的重复性所引入的不确定度分量已包含在各种因素造成的重复性影响修正值不确定度分量中。
根据电子天平的检定证书，天平的分辨率为0.1 mg，称样量m≤50 g时，最大允许误差为±0.5 mg，称取样品2 g，按均匀分布，则不确定度为：
则称重的相对标准不确定度为：
2.2.2 样品定容过程中引入的不确定度
样品定容过程中的不确定度主要是容量瓶的准确性和温度变化两个方面引入的。
2.2.2.1 容量瓶的准确性引入的不确定度
经计量校准，本次实验所用的25 mL容量瓶合格，根据校准证书可得其容量的允许误差为±0.03 mL，按均匀分布，则相对标准不确定度为：
2.2.2.2 温度变化引入的不确定度
玻璃器具出厂校准温度与实验室使用温度的差异是温度变化引入的不确定度，已知玻璃器具的校准温度为20 ℃，本实验室实际使用温度变化范围为±3 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，则不确定度分量为：
2.2.2.3 定容过程中引入的相对标准不确定度
2.2.3 由标准曲线求得结果引入的不确定度
脱氢乙酸标准物质的纯度、标准溶液的配制过程和拟合标准曲线非线性所引入的不确定度是标准曲线求得结果引入的不确定度主要来源。
2.2.3.1 脱氢乙酸标准物质纯度引入的不确定度
由标准物质证书可知，本实验所用的脱氢乙酸标准物质的纯度为99.9%，其相对扩展不确定度为2%，k=2，则标准物质引入的相对标准不确定度为：
2.2.3.2 标准溶液配制过程中称量标准物质引入的不确定度
由本实验所用电子天平的检定证书可知，天平的分辨率为0.01 mg，称样量m≤5 g时，最大允许误差为±0.05 mg，称取标品9.68 mg，按均匀分布，则不确定度为：
则标准品称量的相对标准不确定度为：
2.2.3.3 标准溶液配制过程中所用容量瓶准确性引入的不确定度
本实验采用10 mL A级容量瓶配制标准溶液，其允许误差为±0.020 mL，假设为均匀分布，则相对标准不确定度为：
2.2.3.4 标准溶液配制过程中温度变化引入的不确定度
水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，本实验室使用温度与校准温度变化范围为±3 ℃，则不确定度分量为：
2.2.3.5 标准曲线的拟合引入的不确定度
本实验采用6个浓度水平点的脱氢乙酸标准溶液，每一浓度点测定2次，测定结果见表1。
表1 脱氢乙酸的标准曲线测定结果Table 1 The determination results of standard curves of dehydroacetic acid
本实验对样品测定液进行了6次测定，由直线方程求得各次测量值，计算其平均质量浓度为C=9.834 μg/mL，其相对标准不确定度为：
将以上各计算值带入公式，得标准曲线拟合的不确定度：
=0.00788。
即得由标准曲线求得结果引入的合成相对标准不确定度为：
=0.0131。
2.2.4 各种因素造成的重复性引入的不确定度
在整个处理过程中，因样品前处理的不确定度有温度、时间、加入试剂的量、提取效率、容器附着的量等引入的不确定度分量，可通过平行测定来评估不确定度分量。
在重复性条件下，对样品进行了6次独立测试，脱氢乙酸含量分别是0.122，0.123，0.123，0.121，0.122，0.123 g/kg，则脱氢乙酸含量的平均值为0.122 g/kg，则样品测试的重复性所引入的相对标准不确定度为：
2.3 相对标准不确定度的合成及扩展
2.3.1 各不确定度分量汇总
各相对标准不确定度分量见表2。
表2 相对标准不确定度分量表Table 2 The relative standard uncertainty components
2.3.2 合成相对标准不确定度
对上述各不确定度分量进行分析，合成相对标准不确定度为：
=0.0135。
2.3.3 相对扩展不确定度
取置信概率95%，k=2，得高效液相色谱法测定酱菜中脱氢乙酸的相对扩展不确定度为：
Urel=k×Urel(y)=2×0.0135=0.0270。
2.3.4 扩展不确定度
由实验数据可知样品中脱氢乙酸含量为0.122 g/kg，其扩展不确定度为：
U=0.122×0.0270=0.003 g/kg。
2.3.5 结果表示
通过高效液相色谱法测定酱菜中脱氢乙酸含量，测定结果为：
X=(0.122±0.003) g/kg，k=2。
3 结论
参照GB 5009.121-2016中的方法，采用高效液相色谱法对酱菜中脱氢乙酸的含量进行了测定，并根据JJF 1059.1-2012和CNAS-GL006-2019中规定的方法和程序，对实验过程中影响脱氢乙酸含量的各不确定度进行分析和评定。通过分析发现，对测定结果影响最大的是由标准曲线所求得的浓度，其次是测定的重复性。而样品称量和样液定容所引入的不确定度较小。因此，在实验过程中我们应选择质量稳定、准确度等级较高的标准品，严格把控标准品的配制过程，其次可增加标准溶液的浓度点和测定次数，加强操作人员的培训，检测仪器的校准等措施减小测定结果的不确定度，从而提高检测结果的准确性。
