酶比色法测定特殊医学用途配方食品中的胆碱含量
2021-10-15梁喜玲卢高超石旭东
梁喜玲，卢高超，石旭东，兰 萌
（1.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安710048；2.陕西西咸新区水务集团有限公司；陕西西安710048）
0 引言
胆碱（Choline）是一种季铵盐小分子，1849年首次从猪肝中被分离出来，于1862年首次定名，1866年被人工合成出来，化学名称为β-羟乙基-三甲胺，分子式为C5H15NO2[1]，相对分子质量为121.18，是一种强的有机碱性化合物，热稳定性相对较好，但在酸性或碱性条件下却不是很稳定[2]。胆碱及其衍生物广泛存在于人体中，具有相当重要的生物功能[3]，通常情况下在动物有机体内主要以游离态胆碱、乙酰胆碱、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在。胆碱及其衍生物，其本质上是一种水溶性的维生素，在维持正常的人体机能方面有着相当重要的作用，通过大量的试验探究发现，在大脑的发育及代谢、神经系统信息传递、视力的增强及钙的代谢等功能方面，胆碱均有积极的促进和改善功能[4]。人体一旦缺乏胆碱可能会引起干细胞受损、肾脏损害、记忆力损伤等一系列疾病[5-6]。虽然人体缺乏胆碱会带来相关疾病，但是过量摄入胆碱的风险也不是很明确，因此胆碱的摄入量只需满足机体需求即可，无需过量摄入。胆碱是一种重要的营养物质，人体在肝脏中也可以合成胆碱，但人体自然合成的胆碱不足以满足人类的正常需要，因此从食物中摄取大部分胆碱是很有必要的[7]。人类必须从饮食中获得一定量的胆碱，尤其是一些特殊的人群，比如孕产妇，除正常的饮食摄取胆碱以外，可以适当补充一些添加了胆碱的特殊营养物质。
胆碱作为食品的营养强化剂，主要的化合物来源有2种，氯化胆碱和酒石酸氢胆碱。GB 5413.20—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》中的酶比色法做为检测方法中比较常用的方法，所以建立准确、可靠的检测方法，可以作为特殊医学用途配方食品中营养强化剂质量控制的强有力后盾，为保障生命体健康和安全的提供有力技术支撑。目前，对于婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定报道的相对较多，然而对另外一些特殊人群，如孕产妇，其营养补充剂配方食品中胆碱含量的检测方法报道相对较少。因此，建立快速准确的胆碱类物质检测方法对于一些特殊配方的食品具有重要意义。
目前，对于胆碱的检测方法中报道比较多的有酶比色法、雷氏盐比色法[8-9]、高效液相色谱法[10-13]及毛细管电泳法[14]等。酶比色法为GB 5413.20—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》[15]中的第一法，是目前检验机构主要采用的方法，该方法优点较多，例如专属性比较强、操作简便、重复性好、检出限低、安全性高[16]。试验拟采用质控样品、精密度试验、加标回收试验和实际样品测试研究酶比色法用于检测特殊医学用途配方食品中（孕产妇营养补充剂）胆碱含量的适用性。
1 试剂与仪器
1.1 样本与试剂
不同批次的孕产妇营养配方谷粉，2个不同厂家各3批次，总共6个样本均由企业提供。
胆碱酒石酸氢盐标准品；磷脂酶D、胆碱氧化酶和过氧化物酶，美国Sigma公司提供，酶的保存需要注意其保存条件；其他常规试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅、ATL-224型电子天平、T9CS型紫外-可见分光光度计等。
1.3 试验方法
1.3.1 样本的前处理
样本的前处理过程完全参照国家标准GB 5413.20—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》中的方法进行。
1.3.2 标准溶液配制
胆碱氢氧化物标准储备液（质量浓度2.5 mg/mL）与胆碱氢氧化物标准工作液（质量浓度250 μg/mL）的配制均参照国标方法进行。
1.3.3 发色剂配制
取苯酚50 mg、4-氨基安替比林15 mg、胆碱氧化酶（100~120活力单位）10~15 mg、过氧化物酶（250~280活力单位）1.95~2.35 mg和磷脂酶D（75~100个活力单位）1.80~2.00 mg放置于100 mL容量瓶中，用Tris缓冲溶液（0.05 mol/L）稀释到刻度线。现用现配。
1.4 加标回收率试验
在相同的条件下，将质控样和6个样本在同样方法下进行测定，得到其胆碱含量。测定质控样的胆碱含量后，与该理论值进行比对，对试验结果的可靠性进行验证。加标回收试验：对已测得胆碱含量的样本，加入一定量的胆碱氢氧化物标准储备溶液（其质量浓度为2.5 mg/mL）。测定样本、加标样品、质控样和加标质控样，试验测定结果进行比对，同时考查加标回收率的情况。
1.5 精密度试验
1号营养配方食品产前专用产品作为精密度测试试验的研究对象。分别称取1号样本6份，在相同的试验条件下，平行测定6份产品中的胆碱含量，研究试验方法的精密度情况。
1.6 数据处理
采用常用软件Excel软件进行数据分析处理。
2 步骤分析
2.1 标准曲线的绘制
按照GB 5413.20—2013中的方法，分别移取一定体积的胆碱标准工作溶液（2，4，6，8 mL）用蒸馏水定容于10 mL容量瓶。另准备6支试管，分别做好标记，管A作为试剂空白管，其余5支由1到5编号备用。参照表1中的试剂添加量，加入不同梯度的试剂，然后按照GB 5413.20—2013中的方法进行处理。加入发色剂后，盖塞密封，混匀，然后将所有试管放置于37℃的恒温水浴中保温反应15 min。
标准曲线制备时的试剂添加量见表1。
表1 标准曲线制备时的试剂添加量
15 min反应结束之后，标准溶液的颜色发生明显的变化。
标准溶液梯度颜色见图1。
图1 标准溶液梯度颜色图
参照国家标准GB 5413.20—2013中胆碱的测定方法，将标准系列溶液用紫外分光光度计进行测定，标准曲线的横坐标为胆碱标准溶液的质量浓度（μg/mL），纵坐标为相应的吸光度，绘制标准曲线图，所拟合的标准曲线线性方程为Y=0.003 0X+0.026 5，R2=0.999 7，线性良好，可以采用。
胆碱的标准曲线图见图2。
图2 胆碱的标准曲线图
2.2 试样的测定
样本的测定中，按照表2所示的试剂添加量进行试验，每个试样分别准备（B、C）2支试管。
样本测定时的试剂添加量见表2。
表2 样本测定时的试剂添加量
在做标准系列溶液的同时，样本也参照方法同时进行。
3 结果与分析
3.1 样本测定结果
取质控样品和6个不同批次的样本5 g，同一种样品均取平行样，分别测定胆碱含量。该方法的检出限为1 mg/100 g，定量限为3 mg/100 g。
质控样和6个样本的胆碱含量见表3。
表3 质控样和6个样本的胆碱含量
3.2 加标回收验证试验结果
加标回收率试验见表4。
表4 加标回收率试验
在表4中，前6组数据是1号样本的加标回收试验，最后一组是质控样本（样品质量为2.501 6 g）的加标回收试验。由表4可知，特殊医学用途配方食品样本和质控样的加标回收率均较高，样本的回收率结果为93.2%~96.6%，质控样为95.00%，相对标准偏差为0.82%，值相对较小，由加标回收率试验结果可以看出，酶比色法适合检测特殊医学用途配方食品中的胆碱含量，由上述可说明该方法可靠性高，具有较好的准确度。
3.3 精密度试验结果
1号样本精密度试验结果见表5。
表5 1号样本精密度试验结果
由表5可知，对1号样本测定6次平行试验的结果进行分析，胆碱含量平均值为126.35 mg/100 g，相对标准偏差为1.15%，表明该方法的精密度较好，可以满足检测要求。
4 结论
研究中婴幼儿配方粉质控样胆碱含量理论值与测定值在允许误差范围内，证明测定结果具有可靠性；质控样和1号样本的加标回收率为93.2%~96.6%，相对标准偏差为1.15%，证明GB 5413.20—2013中的酶比色法准确度较高，精密度较好，测定结果准确、可信。并且该6批次市售的特殊医学用途配方食品中胆碱含量均符合该企业标准中对胆碱含量添加量的要求，表明酶比色法适合检测特殊医学用途配方食品中的胆碱含量，具有实际参考价值。
