NEAT1通过miR-504-5p调控主动脉粥样硬化模型细胞生物学功能

周倩 李双阳 徐萍 黄晓宇 陈婧 白雪

(1西南医科大学附属中医医院心脑病科，四川 泸州 646000；2邛崃市中医医院内科；3都江堰市医疗中心消化内科)

动脉粥样硬化是一种严重威胁人类生命健康的心血管疾病。平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和迁移是动脉粥样硬化的主要病理基础〔1〕，抑制主动脉VSMCs的过度增殖和迁移对于动脉粥样硬化的治疗有重要意义。NEAT1是一种长链非编码RNA(LncRNA)，其在胃癌、骨肉瘤、胶质瘤等肿瘤细胞中表达升高，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，进而促进肿瘤的发展进程〔2～4〕。但是，NEAT1对VSMCs增殖、迁移和侵袭的影响还未知。生物信息学软件预测显示，NEAT1可能靶向结合miR-504-5p。研究显示，冠状动脉粥样硬化患者血清中miR-504-5p表达降低〔5〕。然而，miR-504-5p对VSMCs增殖、迁移和侵袭的影响也还未知。本研究采用血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导VSMCs，探讨NEAT1对VSMCs增殖、迁移和侵袭的影响及其可否调控miR-504-5p表达发挥作用。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人主动脉VSMCs购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青；DMEM培养基、双荧光素酶活性检测试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒均购自北京索莱宝；胰蛋白酶、AngⅡ和噻唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；聚合酶链反应(PCR)引物购自上海生工生物工程有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自大连宝生物；si-NEAT1、si-NC、miR-144-3p mimics、miR-NC、anti-miR-504-5p及anti-miR-NC均购自广州锐博生物技术公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、 P21、基质金属蛋白酶(MMP)-2和E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 从液氮罐中取出VSMCs冻存管，用镊子夹住冻存管于37℃水浴中不停摇动，使其在1 min内快速溶解。在超净工作台中将细胞冻存液转移至15 ml离心管中，加适量磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次。1 000 r/min离心5 min，吸弃PBS，加入少量含10%FBS的 DMEM培养基，混悬细胞，制成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至25 cm2细胞培养瓶中，并置于培养箱中培养。及时更换培养基，当细胞融合至80%时，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。

1.2.2细胞转染 将对数期VSMCs细胞接种于6孔板(1.0×105个/孔)。培养24 h后，更换无FBS的培养基。采用LipofectamineTM2000脂质体转染法，分别转染si-NEAT1、si-NC、miR-504-5p mimics、miR-NC、共转染si-NEAT1与anti-miR-504-5p、si-NEAT1与anti-miR-NC。转染12 h后，更换为含10% FBS的 DMEM培养基。再培养24 h，实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR),检测NEAT1或miR-504-5p水平评价转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.2.3qRT-PCR检测细胞中NEAT1和miR-504-5p表达水平 Trizol试剂提取细胞中总RNA，经逆转录为cDNA后，行PCR扩增。NEAT1正向序列5′-GUCUGUGUGGAAGGAGGAATT-3′，反向序列5′-UUCCUCCUUCCACACAGACTT-3′；GAPDH正向序列5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向序列5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；miR-504-5p正向序列5′-AGACCCTGGCATGGAACGT-3′，反向序列5′-GGTCCTGGAACTGACGTGG-3′；U6正向序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法计算NEAT1相对于GAPDH、miR-504-5p相对于U6的表达量。

1.2.4细胞分组 未转染的VSMCs分为对照组和AngⅡ组，其中对照组细胞常规培养基培养；AngⅡ组细胞用含10-7mol/L〔6〕AngⅡ的培养基培养。转染si-NEAT1、si-NC、miR-504-5p mimics、miR-NC、共转染si-NEAT1与anti-miR-504-5p、si-NEAT1与anti-miR-NC的细胞均使用10-7mol/L AngⅡ的培养基培养，并依次标记为AngⅡ+si-NEAT1组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+miR-504-5p组、AngⅡ+miR-NC组、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p组、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC组。

1.2.5MTT检测细胞增殖活性 VSMCs或转染后的VSMCs均接种于96孔板中(2.5×104个/孔)，培养12 h后，按1.2.4分组处理。分别培养24、48、72 h后，加20 μl MTT(5 mg/ml)。孵育4 h，弃培养基，加150 μl二甲基亚砜，振荡混匀后，于酶标仪490 nm处测光密度(OD)值。

1.2.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 将VSMCs或转染后的各组VSMCs均接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，培养12 h后，按1.2.4分组处理。培养24 h后，收集各组细胞，并将细胞密度调整为5.0×104个/ml。迁移实验：在Transwell上室加100 μl各组细胞悬液，下室加500 μl含FBS的RPMI 1640培养基。培养24 h，弃培养基，用4%多聚甲醛固定30 min。然后再用0.4%结晶紫染色15 min，倒置显微镜观察并计数。侵袭实验：预先在Transwell上室铺基质胶，自然晾干后，再加100 μl细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验 由上海生工生物工程有限公司根据靶基因在线软件预测显示的NEAT1与miR-504-5p的结合位点，构建NEAT1野生型荧光素酶报告载体(NEAT1-WT)，并利用基因突变技术将结合位点突变，构建NEAT1突变型光素酶报告载体(NEAT1-MUT)。将对数期VSMCs接种于6孔板(1.0×105个/孔)。培养24 h后，更换无FBS的培养基。采用LipofectamineTM2000脂质体转染法，分别共转染WT-NEAT1与miR-504-5p mimics或miR-NC、MUT-NEAT1与miR-504-5p mimic或miR-NC。转染12 h后，更换为含10%FBS的 DMEM培养基。再培养24 h后，收集细胞。加细胞裂解液将细胞充分裂解，离心(3 500 r/min、5 min)后取上清，利用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海参的荧光强度比值表示。

1.2.8Western印迹检测蛋白表达 将VSMCs或转染后的各组VSMCs均接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，培养12 h后，按1.2.4分组处理。再培养24 h后，收集各组细胞。用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，经BCA法定量、电泳、转膜及封闭后，分别于CyclinD1(稀释度1∶600)、P21(稀释度1∶800)、MMP-2(稀释度1∶400)、E-cadherin(稀释度1∶1 000)和GAPDH(稀释度1∶1 000)一抗中4℃孵育过夜。洗膜后，再于山羊抗兔二抗中37℃孵育1 h。最后滴加显影液避光显影，曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对于GAPDH表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1AngⅡ对VSMCs NEAT1和miR-504-5p表达的影响 AngⅡ组NEAT1水平明显高于对照组，而miR-504-5p水平明显低于对照组(均P<0.001)。见表1。

表1 NEAT1、miR-504-5p在AngⅡ作用的VSMCs中的表达

2.2敲减NEAT1对诱导的VSMCs增殖的影响 转染si-NEAT1的VSMCs中NEAT1表达量(0.25±0.02)明显低于转染si-NC的VSMCs(1.00±0.05，t=41.781，P<0.05)，说明敲减NEAT1的VSMCs构建成功。AngⅡ组CyclinD1水平和24 h、48 h、72 h细胞活性明显高于对照组，而P21水平明显低于对照组(均P<0.05)；AngⅡ+si-NEAT1组CyclinD1水平和24 h、48 h、72 h细胞活性明显低于AngⅡ+si-NC组，而P21水平明显高于AngⅡ+si-NC组(均P<0.05)。见图1、表2。

1～4：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+si-NEAT1组

表2 敲减NEAT1对AngⅡ诱导的VSMCs增殖的影响

2.3敲减NEAT1对AngⅡ诱导的VSMCs迁移和侵袭的影响 与对照组比较，AngⅡ组迁移细胞数和侵袭细胞数明显升高(均P<0.05)，MMP-2蛋白水平明显升高(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平明显降低(P<0.05)。与AngⅡ+si-NC组比较，AngⅡ+si-NEAT1组迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少(均P<0.05)，MMP-2蛋白水平明显降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图2、表3、图3。

图2 AngⅡ诱导的敲减NEAT1的VSMCs细胞迁移、侵袭(结晶紫，×200)

表3 抑制NEAT1对AngⅡ作用的VSMCs迁移、侵袭的影响

1～4:对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+si-NEAT1组

2.4NEAT1靶向调控miR-504-5p表达 生物信息学软件预测显示的NEAT1与miR-504-5p的结合位点见图4。双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组比较，miR-504-5p组WT-NEAT1水平明显降低(P<0.05)，见表4。转染si-NEAT1的VSMCs中miR-504-5p表达量(2.16±0.21)明显高于转染si-NC的VSMCs(1.00±0.01，t=16.553，P<0.05)，说明敲减NEAT1可促进VSMCs中miR-504-5p的表达。

图4 NEAT1与miR-504-5p的核苷酸序列存在结合位点

表4 双荧光素酶报告实验

2.5过表达miR-504-5p对AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭的影响 转染miR-504-5p mimics的VSMCs中NEAT1表达量(2.23±0.2)明显高于转染miR-NC的VSMCs(1.00±0.04，t=16.502，P<0.05)，说明过表达miR-504-5p的VSMCs构建成功。与AngⅡ+miR-NC组比较，AngⅡ+miR-504-5p组CyclinD1、MMP-2水平明显降低，24 h、48 h及72 h细胞活性明显降低，迁移和侵袭细胞数明显减少，而P21、E-cadherin水平明显升高(均P<0.05)。见表5、图5、图6。

表5 过表达miR-504-5p对AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移、侵袭的影响

图5 AngⅡ诱导的过表达miR-504-5p的VSMCs迁移和侵袭(结晶紫,×200)

图6 AngⅡ诱导的过表达miR-504-5p的VSMCs相关蛋白表达

2.6敲减miR-504-5p降低敲减NEAT1对AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭的作用 与AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC组相比，AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p组迁移和侵袭细胞数明显增加，24 h、48 h及72 h细胞活性明显升高，CyclinD1及MMP-2水平明显增加，而P21和E-cadherin水平明显下降(均P<0.05)。见表6、图7、图8。

表6 敲减miR-504-5p降低敲减NEAT1对AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移、侵袭的作用

1～2：AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-NC组、AngⅡ+si-NEAT1+anti-miR-504-5p组，下图同

图8 AngⅡ诱导的共转染si-NEAT1与anti-miR-504-5p的VSMCs相关蛋白表达

3 讨 论

动脉粥样硬化是多种原因导致的复杂疾病，多发生于老年人。血管VSMCs是血管壁的重要组成部分，其过度增殖和迁移可促进动脉粥样硬化病变形成〔7〕。AngⅡ是已知的缩血管活性物质之一，在维持血管壁的结构和完整性中起重要作用。Zhang等〔8〕研究显示，AngⅡ可促进VSMCs增殖、迁移和侵袭，这与本研究结果一致，说明AngⅡ可促进动脉粥样硬化的发展进程。LncRNA可在转录、转录后、表观遗传等多个方面参与调控细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为，其在动脉粥样硬化发病机制中的作用越来越受到重视〔9〕。Cui等〔10〕研究显示，LncRNA 430945在动脉粥样硬化组织中升高，上调LncRNA 430945可促进AngⅡ诱导的VSMCs增殖和迁移，其作用机制可能与激活ROR2/RhoA信号传导途径有关。刘彦廷等〔11〕研究显示，LncRNA GASL1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进血管VSMCs增殖。

作为一种lncRNA，NEAT1参与多种疾病的发展进程。Wang等〔12〕研究显示，NEAT1在骨肉瘤细胞中高表达，敲减NEAT1可有效阻碍骨肉瘤细胞增殖和侵袭，NEAT1有可能成为骨肉瘤治疗的分子靶点。Mang等〔13〕研究显示，NEAT在肝细胞癌组织中表达上调，下调NEAT能够降低肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，延缓肝癌发展进程。但目前，NEAT1对VSMCs增殖、迁移和侵袭的影响还未知。本研究结果提示敲减NEAT1对AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用。CyclinD1和P21是细胞增殖的关键调控分子，其中CyclinD1表达的升高可促进细胞周期进程，进而促进细胞增殖，而P21对细胞增殖起抑制作用〔14〕。MMP-2表达的增加可加剧细胞外基质的降解，进而促进细胞迁移和侵袭〔15〕。E-cadherin是上皮蛋白标志物，可维持细胞与细胞间的黏附能力，其表达增加抑制细胞的迁移和侵袭〔16〕。本研究结果说明敲减NEAT1抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭，NEAT1可能是动脉粥样硬化治疗的潜在靶点。

本研究证实了NEAT1在VSMCs中靶向结合并负调控miR-504-5p表达。miR-504-5p是一种肿瘤抑制因子，在下咽鳞状细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表达降低，过表达miR-504-5p对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用，可通过上调miR-504-5p表达抑制肿瘤的发展进程〔17,18〕。

本研究结果提示miR-504-5p对动脉粥样硬化的发生发展也起抑制作用，NEAT1可能通过靶向负调控miR-504-5p的表达来影响AngⅡ诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭，但其具体影响的miR-504-5p的靶基因还有待进一步探究。