miR-141对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

晓映 吴优 张华 张跃平 李文光

(南通大学附属医院泌尿外科，江苏 南通 226001)

膀胱癌是一类发生于膀胱黏膜上的恶性肿瘤，也是临床上常见的恶性泌尿系统肿瘤类型之一〔1〕。膀胱癌发病原因较为复杂，有内在遗传和基因因素，外在的环境因素。研究显示基因等内在因素是导致肿瘤发生的根本因素。因此从基因角度阐明膀胱癌发病机制成为目前研究的热点。非编码RNA早期被认为是一种无功能RNA，近期较多的报道表明，非编码RNA参与胚胎发育、转录调控和蛋白翻译等多种生物学功能〔2,3〕。miR-141是一类非编码RNA，其主要通过靶向下游基因的3′UTR区域，进而调节下游靶基因的表达。近年来研究显示其参与了不同的病理学过程，如肿瘤的增殖、凋亡、迁移、上皮间质转化和肿瘤耐药等〔4～6〕。本研究拟分析miR-141在膀胱癌组织的表达及其对膀胱癌细胞生命活动的影响，为膀胱癌临床诊治提供依据。

1 材料和方法

1.1临床资料 在南通大学附属医院医学伦理委员会指导下，收集2017年6月至2018年12月南通大学附属医院收治且确诊的108例膀胱癌患者作为研究对象，其中女30例，男78例，年龄35～81岁，平均年龄(60.32±12.44)岁。参照世界卫生组织(WHO)肿瘤病理分级标准：G3 58例，G2 29例，G1 21例；肿瘤临床分期按照TNM标准：T1～T2 49例，T3～T4 59例；肿瘤生长方式：秃头状45例，浸润性63例；淋巴结转移45例，未见淋巴结转移63例。癌旁组织经病理学检测未见病理改变。患者或家属均了解本研究的目的与内容并签署知情同意书。

1.2实验材料 BIU-8膀胱癌细胞系购自美国ATCC细胞库；胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、Lipofectamine 2000转染试剂及青链霉素均购自美国Gibcon公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗、人类runt相关转录因子(RUNX)3、微管蛋白(Tubulin)单克隆抗体均购自美国Santa cruz公司；逆转录试剂盒、miRNA提取试剂盒和qPCR Mix购自南京诺唯赞生物有限公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promaga公司；5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、CCK8细胞凋亡及增殖试剂盒均购自上海碧云天生物有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；CFX96型荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3稳定细胞系构建 BIU-8膀胱癌细胞以DMEM培养(含10%胎牛血清)，细胞至指数生长期时，消化并调整密度1×106个/ml，每孔200 μl接种至6孔板。细胞贴壁时，分别加入miR-Control慢病毒或miR-141抑制剂慢病毒，感染24 h，用含2 μg/ml嘌呤霉素培养基处理细胞，杀死未成功感染的细胞，存活的细胞分别命名为miR-141 KD组和miR-Control组。

1.4荧光定量PCR体系建立 膀胱癌组织和癌旁组织及miR-141 KD组和miR-Control组，以miRNA提取试剂盒提取组织或细胞总miRNA，逆转录cDNA。引物由上海生物工程有限公司合成，信息如下： miR-141-正义链:5′-ATCGGCGATCGCAACAGCCCA-3′;miR-141-反义链:5′-ATC GGT TTAAACAAGGTTCAGC-3′;U6正义链:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′;U6反义链:5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。PCR条件：95℃预变性30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 30s，40个循环。以Bio-Rad荧光定量PCR系统进行实验，U6为内参，计算组织或细胞miR-141 mRNA相对表达水平。

1.5EdU染色 胰酶消化miR-141 KD组和miR-Control组培养至指数生长期的细胞，调整密度为2×105个/ml，每孔200 μl接种于12孔板中，细胞贴壁后，将37℃预热的2X的EdU工作液(20 μmol/L)，等体积加入6孔板，继续孵育细胞120 min，EdU标记细胞，去除培养液，加入1 ml 4%固定液室温固定15 min，去除固定液，洗涤细胞，加入0.5 ml Click反应液，混匀，室温避光孵育30 min，去除炔烃+叠氮“点击”Click反应液，洗涤，Hoechst 33342溶液染核，洗涤，镜下观察细胞增殖。

1.6CCK8分析 同1.5步骤至细胞贴壁，分别于0、24、48和72 h加入20 μl CCK8试剂，孵育2 h后，检测波长450 nm下的吸光度，每个时间点重复3次。

1.7细胞凋亡检测 同1.5步骤至调整细胞密度为2×106个/ml，洗涤细胞，加入500 μl结合液轻轻重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀，避光孵育10 min，洗涤游离染料，再加入5 μl PI，轻轻混匀，3 min后进行流式细胞仪检测。

1.8双荧光素酶报告基因 生物信息学预测miR-141靶基因可能是RUNX3。参考miR-30与RUNX3 3′-UTR的互补序列，设计缺失miR-141结合区域的突变体RUNX3 3′-UTR(RCAN1-Mut)及野生型RUNX3 3′-UTR(RCAN1-WT)序列，构建荧光素酶报告载体。将RUNX3-Mut和RUNX3-WT荧光素酶报告质粒分别转染到miR-141 KD组和miR-Control组，采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转染48 h的荧光素酶活性。

1.9Western印迹 收集miR-141 KD组和miR-Control组，以蛋白酶抑制剂的细胞裂解液重悬，在冰上裂解30 min,于4℃ 15 000 r/min离心15 min，留取上清，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒对蛋白进行检测。将蛋白和缓冲液加入，99℃煮5 min使蛋白变性，进行凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上， 5%牛血清蛋白封闭1 h，将一抗RUNX3和Tubulin小鼠单克隆抗体1∶1 000稀释后， 4℃下过夜孵育，PBST 洗涤3次，将二抗加入，室温下反应60 min，PBST洗涤3次，加入 ECL化学发光试剂，显影拍照，以Tubulin蛋白为参考分析RUNX3相对表达量。

1.10统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1膀胱癌组织和膀胱癌细胞miR-141表达 与癌旁组织(1.05±0.22)比，膀胱癌组织中miR-141表达(2.21±0.20)显著升高(t=40.546,P<0.05，n=108)。与miR-Control组(1.00±0.15)比，miR-141 KD组miR-141表达(0.31±0.13)显著下调(t=6.021,P<0.05，n=3)。

2.2miR-141对细胞增殖的影响 与miR-Control组比，miR-141 KD组EdU阳性率显著下调〔(10.26±1.25)% vs (6.95±1.36)%;t=3.103,P<0.0.5〕。与miR-Control组比，miR-141 KD组的增殖能力显著下调(P<0.05)。见图1和表1。

图1 miR-141表达对膀胱癌细胞增殖的影响(Edu染色，×100)

2.3miR-141对膀胱癌细胞凋亡的影响 与miR-control组〔(5.12±0.98)%〕比，miR-141 KD组凋亡水平〔(33.41±6.15)%〕显著增加(t=7.868,P<0.05)。见图2。

2.4miRNA-141靶基因分析 采用生物信息学分析miR-141的靶基因，发现RUNX3可能靶点是miR-141，miR-141与RUNX3 3′-UTR存在7个碱基互补。miR-141 KD组转染RUNX3-WT的细胞荧光素酶活性(1.01±0.14)显著低于miR-control组荧光素酶活性(1.87±0.17，t=6.764,P<0.05)；miR-Control和miR-141 KD组转染RUNX3-Mut的荧光素酶活性〔0.99±0.21 vs 1.01±0.14〕差异无统计学意义(t=0.137，P>0.05)。

2.5miR-141对RUNX3表达水平的影响 与miR-Control组RUNX3蛋白(1.06±0.18)比较，miR-141 KD组中RUNX3蛋白表达(2.21±0.35)显著增加(t=5.061,P<0.05)。见图3。

表1 miR-141表达对膀胱癌细胞增殖的影响

图2 流式细胞术分析miR-141对细胞凋亡水平的影响

图3 Western印迹分析miR-141对RUNX3表达水平的影响

3 讨 论

微小RNA是一类非编码单链RNA分子，参与动植物的转录后基因表达调控。miR-141作为众多miRNA家族成员之一，其具有重要的生物学功能。目前研究显示miR-141在胃癌、非小细胞肺癌、肝癌及乳腺癌中扮演着重要的角色，而且在不同的肿瘤组织中，miR-141的功能不尽相同，在某些肿瘤中是抑癌基因，在其他肿瘤中则为癌基因〔7～9〕。miR-141对膀胱癌的细胞生物学行为,特别是增殖和凋亡如何影响，及其分子机制目前研究尚少。本研究采用荧光定量PCR研究显示在膀胱癌组织中miR-141表达水平显著增加，提示miR-141在膀胱癌中可能扮演着癌基因角色。在膀胱癌细胞中通过慢病毒建立miR-141 KD的稳定细胞系，体外细胞增殖实验显示miR-141沉默后显著降低了膀胱癌细胞的增殖，可见miR-141具有促癌作用。此外，采用流式细胞术分析显示，miR-141沉默显著增加了膀胱癌细胞的凋亡水平，也说明miR-141参与了细胞凋亡。

miRNA通过靶向下游靶基因3-UTR区域，进而降解靶基因mRNA水平。生物信息学研究显示RUNX3是miR-141的靶基因。RUNX3蛋白是转录生长因子β信号通路下游的转录因子，转化生长因子(TGF)-β与RUNX3相互作用可导致Smad2和Smad3的激活，从而诱导相关目的基因咋细胞中转录和表达〔10,11〕。RUNX3作为抑癌基因，主要表现为跟基因在各种肿瘤组织标本即细胞系中呈低水平表达，从而使信号通路异常，细胞抑制调节效应失灵，细胞增殖明显，而凋亡减少。研究显示RUNX3高表达可上调凋亡相关蛋白Bim的表达水平，进而促进肿瘤细胞的凋亡，达到抗肿瘤的效果〔12〕。本研究显示，miR-141沉默可显著增加RUNX3蛋白表达水平。RUNX3蛋白水平增加则诱导细胞凋亡，抑制了细胞增殖。

本研究结果显示，膀胱癌miR-141在膀胱癌组织中呈高表达状态，抑制了抑癌基因RUNX3蛋白的表达，降低了细胞凋亡，促进了细胞增殖。本研究为膀胱癌治疗提供了靶点和理论依据。