大鼠心肌梗死后迷走神经重构及毛果芸香碱的心脏保护作用

孙责 于海波 薛晴 于海涛 贾琳琳 王芳芳 关政 李晶，4

(佳木斯大学 1附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007；2研究生院； 3基础医学院；4黑龙江省微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室)

心血管疾病发病率在不断增加〔1～4〕，致残率和致死率在全球范围呈现高趋势发展的就是急性心肌梗死(AMI)〔5〕。要降低这些概率就要及时发现、正确诊断和治疗〔6〕。由于冠状动脉缺血缺氧后会有心肌坏死(临床表现为典型的胸骨后疼痛)而诱发心力衰竭，进而危及生命〔7〕，最终造成机体死亡〔8，9〕。由于AMI是心血管疾病患者死亡的主要原因〔10〕，目前常规传统的治疗方法已取得一定成效，如溶栓、药物、介入手术、冠状动脉搭桥术等。但对一些特殊病变(如弥漫性、复发性、多支病变)传统治疗方法效果并不好〔11，12〕，造成患者生活质量明显下降〔13〕。而自主神经异常，尤其是迷走神经重构与心肌梗死后患者猝死关系紧密，由于迷走神经节后纤维释放递质乙酰胆碱作用于心肌细胞的M受体而发挥作用；研究发现对很多心血管病起到保护作用的是M3受体，作为M3受体激动剂的毛果芸香碱(pilcocarpine)目前主要用于临床眼科治疗(青光眼)、口干燥症、阿托品中毒等〔14〕，其对心脏的保护作用和内脏痛的治疗研究甚少。因此，本研究探讨大鼠心肌梗死后迷走神经重构及毛果芸香碱的心脏保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只雄性SPF级SD大鼠(体重约220 g)，购自哈尔滨医科大学实验动物中心，合格证书：SYXK(黑)2018-001，实验经过佳木斯大学伦理委员会批准，并依据实验动物的3R 原则施行人道主义关怀。

1.2主要试剂与仪器 盐酸毛果芸香碱(上海阿拉丁生活科技股份有限公司)；戊巴比妥钠(天津施维雅制药有限公司)；注射用青霉素(哈药集团制药总厂)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒96T(南京建成生物公司)；PL-200 热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司);2390型电子机械性痛敏仪(美国IITC公司)；BL-420F生物机能实验系统及HX-300S小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；各类哺乳动物手术器械：手术剪、眼科剪、镊子、止血钳、持针器、手术线、注射器、眼科开睑器、扩胸器等。

1.3动物分组与模型建立 大鼠在做手术前均需要禁食、禁水12 h。梗死组模型建立方法：用30 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后背位固定在手术台上，借助小儿喉镜经口进行气管插管，并连好小动物呼吸机(呼吸比调成1∶1，潮气量调成15 ml)，同步记录心电图(ECG)改变(BL-420F 生物信号采集放大系统)。在左侧第4、5肋间隙消毒后开胸，剪破心包膜以便暴露心脏，用7号无菌手术线结扎左前降支冠状动脉(不可过深或过浅，约厚0.5 mm、宽2.0 mm)，若结扎成功肉眼可见心尖部位缺血后颜色变白、搏动减弱，同时能看到ECG中ST段显著高抬〔15〕。假手术组术前准备和梗死组一样，区别在于开胸后看到左冠状动脉前降支后不需要结扎，只是把手术线从其下方穿过即可。毛果芸香碱组术前操作步骤及手术方法和梗死组一样，不同在于模型建立成功后需要舌下静脉注射毛果芸香碱，按 0.2 mg/kg持续给药28 d。

1.4描计ECG方法 运用BL-420F 生物信号采集放大系统描计，把大鼠用戊巴比妥钠麻醉成功后，以仰卧位方式固定在大鼠手术台上，将1 ml注射器针头分别插入大鼠的两前肢和右后肢皮下，并且连接不同颜色电极后借助实验系统输出相应的电信号即ECG改变(标Ⅱ导联)，具体电极连接方法是右前肢连白色，右后肢连黑色，左后肢连红色。

1.5检测血清LDH、脂肪酸结合蛋白(FABP)变化 血清LDH、FABP含量的检测用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。具体操作步骤如下：做完实验后各组大鼠取血，离心机离心(3 000 r/min离心10 min)后取上清液备用。按说明书要求，首先加上待检测样品、标准品与平行样本稀释，以加入辣根过氧化物酶一抗作为标志，37℃ 60 min孵育，磷酸盐缓冲液(PBS)洗板5次，37℃避光条件下孵育15 min后加入二抗，后加入显色液及终止液，最后用酶标仪测定OD值。

1.6梗死面积测定 取大鼠心脏分离出心室，以左心室为例，切割2 mm每份的组织(从心尖一直到心底)，在37℃温度下用氯化三苯基四氮唑溶液中孵育10 min，在多聚甲醛中固定24 h。视觉观察到梗死部分心肌组织变白，而非梗死部分是红色的。梗死面积大小测定借助BI-2000医学图像分析系统，具体计算公式为每片切片梗死心肌之和/整个左心室面积×100%。

1.7迷走神经支配密度、M3受体mRNA 迷走神经支配密度(μm2/mm2)的测定用Motic Images3000计算机辅助图像分析系统，等于神经纤维面积/总检测面积。即免疫组化定量分析，组化按常规操作：固定在甲醛溶液中后脱水、浸蜡、包埋后切片，30 min预热，15 min抗原修复后冷却1 h，加一抗后加酶标二抗，中间用PBS冲洗，最后二氨基联苯胺(DAB)显色，阳性为棕色颗粒。M3受体mRNA检测：用试剂盒提取总 RNA，质量分析用凝胶电泳，纯度和含量测定用紫外分光光度计。逆转录反应处理总RNA，其反应产物用于聚合酶链反应(PCR)，密度扫描及UV 照相是把PCR产物借助琼脂糖凝胶后电泳的结果，mRNA相对表达量以M3受体和内参电泳条带的灰度值计算。

1.8机械痛阈与热痛阈的测定 安静室内，适宜温度和湿度，借助PL-200 热刺痛仪检测，计算由于辐射热源刺激大鼠造成缩足反射所需要的时间，即热痛阈。机械痛阈的测定是用美国 IITC 公司生产的 2390 型电子机械性痛敏仪进行，主要计算两后爪的缩足阈值，具体操作为：把大鼠放在透明的有机玻璃盒子中，盒子底部是框架结构，可放入刺激探针。先让大鼠适应这个环境，把直径 0.5 mm探针缓慢垂直抬高，直至碰到大鼠后脚掌中心，刺激强度逐渐加大，直到大鼠脚趾缩回去记录当时的压力值。基础痛阈的测定在术前1 d进行。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.13组ECG改变情况 与术前比较，梗死组ECG出现明显抬高的ST段；毛果芸香碱组抬高的ST段较梗死组显著下降；假手术组未出现明显ST段。

2.23组梗死面积百分率 梗死组心肌梗死面积为(48.93±5.02)%，毛果芸香碱组为(25.67±4.15)%，假手术组为(0.00±0.00)%，3组梗死面积百分率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.33组血清LDH、FABP变化 与假手术组比较，梗死组与毛果芸香组血清LDH、FABP水平显著升高(P<0.05)；与梗死组比较，毛果芸香碱组血清LDH、FABP显著下降(P<0.05)，见表1。

2.43组迷走神经支配密度、M3受体mRNA变化 与假手术组比较，梗死组迷走神经支配密度、M3受体mRNA相对表达量显著增加；与梗死组比较，毛果芸香碱组二者表达均显著降低(均P<0.05)，见表1。

2.53组机械痛阈、热痛阈的改变 治疗前，3组基础痛域无明显差异(P>0.05)；治疗后，毛果芸香碱组内脏疼痛明显缓解；与梗死组比较，毛果芸香碱组机械痛阈显著增加，热痛阈显著降低(均P<0.05)，见表2、表3。

表1 3组外周血血清中LDH、FABP含量及迷走神经支配密度、M3受体mRNA相对表达量比较

表2 3组机械痛阈改变

表3 3组热痛阈改变

3 讨 论

起病危重的AMI最容易出现并发症，致死率很高〔16，17〕。其发生在于不同诱因造成冠状动脉血流不够，出现坏死、水肿、充血，同时伴随炎细胞的出现，导致心肌纤维化，大大降低心功能，表现为心力衰竭。而心力衰竭的出现可能与炎细胞过度激活进而诱导心肌细胞凋亡、坏死有关〔18,19〕。通常情况下，重构或坏死、水肿的心肌一般不能全部恢复正常，因为心肌再生能力有限。另外，一旦心肌出现坏死，还可能出现在坏死部分或坏死周围有一小部分还存活的心肌细胞，这也是AMI出现心律失常的原因。同时，AMI后会伴随心前区的内脏疼痛。因此，AMI研究关键是药物治疗改善症状的同时还要具有减轻内脏疼痛的效果。

AMI发生时，由于坏死和缺血的影响可造成迷走神经的损伤和再生的过程，而自主神经的异常又是造成猝死和心律失常的主要诱因。本研究证明毛果芸香碱具有减轻迷走神经重构，加强再生的神经正常化支配，进而减低并发症和猝死的出现。M3受体可与乙酰胆碱(Ach)递质结合，调节心肌细胞的生理特性(兴奋、传导、收缩性)，同时能介导钾离子通道。本研究提示在病理状态下心肌 M3受体表达会增加，也可能和心肌缺血坏死后钾电流密度增加有关；经毛果芸香碱M3受体激动剂治疗后降低，证实毛果芸香碱能够减弱M3受体mRNA相对表达量，进而调节心肌细胞的生理特性来降低AMI并发症的出现。

生化指标检测在AMI中作用也很大，LDH能判断心肌是否损伤；心脏型脂肪酸立即释放，临床上对肺栓塞、脑卒中的诊断及预后价值较大〔20，21〕。它是判定缺血具有高灵敏度的指标。本研究发现：毛果芸香碱组与梗死组比：血清LDH、FABP下降，可能原因是作为脂质代谢调节因子的FABP可造成脂质代谢紊乱，生成氧自由基，进而造成细胞损伤出现氧化应激反应，破坏正常的心功能引起AMI〔22～24〕。通常情况下，各种社会、心理、身体等诸多因素都会影响痛阈的变化〔25〕，而这些变化的发生都和痛觉的内源性调控相关，在这个系统中存在抑制系统和易化系统，且二者始终处在一种动态平衡状态，因而在一定范围内，生物个体都具有稳定的痛阈。目前，临床镇痛手段有超前镇痛，即把自身内源性镇痛机制及时启动来达到止痛效果。本研究显示AMI大鼠内脏痛的变化，说明毛果芸香碱能够启动并激活内源性调控系统中的抑制机制来降低痛感，减轻痛苦。

综上，毛果芸香碱可借助LDH、FABP水平的下降来削弱心肌损伤和缺血；通过减弱M3受体mRNA相对表达量、减轻迷走神经重构来降低AMI并发症的出现；通过调节痛阈来降低疼痛感。因此，毛果芸香碱具有心肌保护和缓解疼痛的作用，为AMI治疗及疼痛缓解提供了科研依据。