贝伐珠单抗联合高压氧治疗小鼠胶质母细胞瘤的效果

王 鹏 刘邦鑫 张剑宁 陈金辉 常洪波 杨 晨

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是侵袭性极强的颅内恶性肿瘤，即使采用手术联合术后放化疗等综合治疗，中位生存时间仅14 个月[1]。GBM 高表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），理论上抗VEGF 治疗具有良好效果，但Ⅲ期临床试验（AVAglio 和RTOG 0825）表明，贝伐珠单抗（bevacizumab，Bev）、放疗和替莫唑胺的联合治疗方案，并未提高新诊断的GBM病人总生存期[2，3]。并且，抗VEGF靶向治疗后，胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强[4，5]。高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）可抑制基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的表达，从而抑制肿瘤细胞的浸润[6～9]。另外，HBO 可直接抑制肿瘤细胞增殖或通过提高放化疗的敏感性，在多种肿瘤的治疗中发挥作用[10～12]。本文探讨Bev联合HBO对小鼠GBM的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养GBM 细胞系U251 细胞（中国人民解放军空军军医大学神经外科研究所章翔教授惠赠）用含10 ml/L 胎牛血清（美国Gibco 公司）的DMEM（美国Hyclone公司）培养基培养。

1.2 MTT 法检测Bev 作用浓度 将U251 细胞接种至24 孔板，每孔1×104个细胞，1 d 后（细胞贴壁），加入不同浓度Bev（0、2、4、6、8、10 mg/ml）。继续培养2、4、6 d，MTT试剂盒（美国Sigma公司）测定吸光度值，绘制细胞生长曲线，确定后续实验Bev的浓度。

1.3 分组及处理 将U251细胞分为4组：对照组、Bev组、HBO 组和Bev+HBO 组。HBO 处理方案：采用烟台豪特氧业设备有限公司的动物实验舱，按操作说明，在30 min内稳定升高至0.2 MPa，持续60 min，然后在30 min 内降至常压后出舱，加压时注意氧舱温度不超过37℃。对照组不进行任何处理；Bev组加入6 mg/ml的Bev作用24 h；HBO组接受1次HBO治疗；Bev+HBO组在加入6 mg/ml的Bev作用24 h后，接受HBO 治疗1 次。在HBO 组和Bev+HBO 组接受HBO治疗时，对照组和Bev组细胞从孵箱取出，放于室温（25 ℃）120 min。

1.4 MTT 法检测细胞增殖能力 将U251 细胞接种至24 孔板，每孔1×104个细胞，每组接种9 孔。24 h 后（细胞贴壁）行不同处理，继续培养48 h，每组取3孔计数，以MTT法测定吸光度值。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力 以1×105细胞/孔的密度，将U251细胞接种于6孔板中，生长至90%的融合度后，用200 μl枪头垂直于六孔板底部划痕，无血清DMEM 培养液洗去除划下的细胞，以无血清培养基培养。各组细胞行相应处理后，用倒置相差显微镜记录此时及24 h后细胞的迁移情况。

1.6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 基质胶（美国BD公司）包被的Transwell 小室（美国Millipore 公司）放入24 孔培养板中，以5×104细胞/孔的密度，将U251 细胞接种至上室，孔径为8 μm 的滤膜将上室的细胞和下室的培养液隔开。各组行相应处理，以无血清培养基培养24 h 后，将位于滤膜上层的细胞擦除，穿过滤膜，位于滤膜下部的细胞用龙胆紫（美国Sigam公司）染色后，倒置显微镜观察。

1.7 脑胶质瘤裸鼠原位移植瘤模型的建立及实验分组 取100只雄性BALB/c裸鼠[3～4周龄，（14±2）g，斯贝福生物技术有限公司]，参照文献[13，14]在鼠立体定向仪（西安光学仪器厂）辅助下，通过微量进样器，将1×106个U251细胞（2 μl）注射到右侧纹状体，建立荷瘤动物模型。7 d 后将裸鼠随机分为对照组、Bev组、HBO 组和Bev+HBO 组，每组25 只。对照组经腹腔脉注射PBS，3 次/周，连续2 周；Bev 组腹腔注射Bev（5 mg/kg，3 次/周，连续2 周；HBO 组接受HBO 治疗，1 次/d，连续2 周；Bev+HBO 组同时接受Bev 和HBO处理2周。

1.8 小鼠存活时间分析 每组取10只小鼠，记录小鼠存活时间。

1.9 肿瘤体积的评估 造模后21 d，每组取5 只裸鼠采用CO2窒息法处死，参照文献[16]，将小鼠脑组织从瘤细胞接种处一分为二，包埋后连续切三张切片，进行HE 染色（图1），使用NIS-Elements 软件（日本尼康公司）计算每张图像中肿瘤面积，并取平均值，将瘤组织估算成一个球形，计算肿瘤组织的半径r，按公式4πr3/3计算肿瘤体积。

图1 HE染色测定荷瘤裸鼠肿瘤体积

1.10 微血管密度（micro vessel density，MVD）的测定造模后21 d，每组取5 只裸鼠，多聚甲醛灌注固定后分离肿瘤组织，冰冻切片后，采用采用SP 法进行CD34 免疫组织化学染色，按试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明操作。参照Weidner等[17]报道方法测定MVD，高倍镜下（×200）计数CD34 阳性细胞数，单位为个/HP。见图2。

图2 CD34免疫组化染色测定荷瘤裸鼠微血管密度（×200）

1.11 qPCR检测肿瘤组织MMP9 mRNA的表达 造模后21 d，每组选取5 只裸鼠采用CO2窒息法处死，获取颅内肿瘤组织，使用TRIzol 试剂（日本TaKaRa 公司）提取总RNA。使用逆转录系统（日本Toboyo 公司）逆转录成cDNA。qPCR 使用SYBR Premix EX Taq 试剂盒（日本TaKaRa 公司）和ABI PRISM 7300 qPCR 系统（美国Applied Biosystems 公司），以GAPDH为内参，重复三次。采用2-ΔΔCT法量化分析。

1.12 统计学分析 采用SPSS 19.0 进行分析；定量资料用表示，采用方差分析和q检验；非正态分布定量资料采用Kruskal-Wallis H检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bev 的作用浓度 0、2、4、6 mg/ml 的Bev 处理U251 细胞，细胞增殖能力无明显差异（P＞0.05，图3）；8、10 mg/ml的Bev处理U251细胞，细胞增殖能力明显下降（P＜0.01，图3）。因此，选用6 mg/ml 的Bev进行后续实验。

图3 贝伐珠单抗作用U251细胞最佳浓度的确定

2.2 HBO 联合Bev 对U251 细胞增殖能力的影响 与对照组相比，Bev 组U251 细胞增殖能力无明显变化（P＞0.05，图4）；与对照组或Bev 组相比，HBO 组U251 细胞增殖能力明显下降（P＜0.01，图4）。与HBO 组相比，HBO+Bev 组U251 细胞增殖能力明显下降（P＜0.05，图4）。

图4 HBO联合Bev对U251细胞增殖能力的影响

2.3 HBO联合Bev对体外培养U251细胞迁移和侵袭能力的影响 与对照组相比，Bev组U251细胞迁移和侵袭能力均明显增加（P＜0.01，图5、6），而HBO 组U251 细胞迁移和侵袭能力均明显下降（P＜0.01，图3、4）；与Bev 组相比，Bev+HBO 组U251 细胞迁移和侵袭能力明显下降（P＜0.01，图5、6）。与HBO 组相比，Bev+HBO 组细胞迁移和侵袭能力均无明显变化（P＞0.05，图5、6）。

图5 HBO联合Bev对U251细胞迁移能力的影响

图6 HBO联合Bev对U251细胞侵袭能力的影响

2.4 HBO 联合Bev 荷瘤裸鼠存活时间的影响 对照组、Bev 组、HBO 组、Bev+HBO 组荷瘤裸鼠中位生存时间（四分位间距）分别为：22（18～27）d、24（20～31）d、23（21～30）d、32（29～39）d。与对照组相比，Bev 组和HBO组荷瘤小鼠的生存时间延长，但无统计学差异（P＞0.05）。与对照组、HBO 组或Bev 组相比，HBO联合Bev组荷瘤裸鼠的存活时间明显延长（P＜0.01）。

2.5 HBO 联合Bev 荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响 对照组、Bev 组、HBO 组、Bev+HBO 组荷瘤裸鼠的肿瘤体积分别为：（32.47±2.09）mm3、（27.51±4.76）mm3、（26.78±4.24）mm3、（16.27±3.03）mm3。与对照组相比，Bev组和HBO组荷瘤小鼠的肿瘤体积缩小，但无统计学差异（P＞0.05）。与对照组、HBO 组或Bev 组相比，HBO+Bev 组荷瘤小鼠的肿瘤体积明显缩小（P＜0.01）。

2.6 HBO 联合Bev 荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响 对照组、Bev 组、HBO 组、Bev+HBO 组荷瘤裸鼠的肿瘤MVD 分别为：（40.17±7.68）个/HP、（28.50±7.06）个/HP、（35.50±5.17）个/HP、（26.17±6.11）个/HP。与对照组相比，Bev 组和HBO+Bev 组MVD 明显减少（P＜0.05），HBO 组MVD 无明显变化（P＞0.05）；Bev 组与HBO+Bev组MVD无统计学差异（P＞0.05）。

2.7 HBO 联合Bev 荷瘤裸鼠肿瘤MMP9 mRNA 表达的影响 与对照组相比，Bev 组MMP9 mRNA 表达水平明显增加（P＜0.01，图7），HBO 组MMP9 mRNA 表达水平明显下降（P＜0.01，图7）；与对照组和Bev 组相比，HBO+Bev 组MMP9 mRNA 表达水平明显下降（P＜0.01，图7）。与HBO 组相比，HBO+Bev 组MMP9 mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05，图7）。

图7 HBO 联合Bev 对荷瘤裸鼠肿瘤组织MMP9 mRNA 表达水平的影响

3 讨论

GBM 属于血管形成极为活跃的实体瘤，VEGF在血管形成中发挥重要作用，GBM 组织VEGF 呈高表达。理论上，VEGF 单克隆抗体Bev 对GBM 有一定的治疗效果。实际上，Bev 联合替莫唑胺和放疗明显延长新诊断的GBM病人无进展生存期，显示了Bev在胶质瘤治疗领域的潜力。然而，Bev可诱导增强胶质瘤细胞侵袭性，并使病人病情迅速恶化，在临床应用中并不能明显延长病人总生存期。如果克服Bev导致的肿瘤细胞侵袭性增强，并增强Bev对肿瘤细胞的抑制作用，对增强Bev的治疗效果有利。

本文结果显示HBO 明显抑制Bev 导致的U251细胞侵袭性增强。以往大量研究显示MMP9在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用，并与肿瘤细胞增殖能力相关[15]。MMP9 的表达水平随胶质瘤病理分级的增高而增加，与GBM 的侵袭性、增殖能力以及病人不良预后有着密切的关系；抑制MMP9，肿瘤细胞的侵袭和增殖能力明显下降。HBO 可明显抑制缺血脑组织、脊髓损伤组织、糖尿病足、损伤血管组织MMP9 的表达，还可下调肿瘤细胞MMP9 的表达，抑制肿瘤细胞的浸润与转移[8，9，18]。本文结果显示，HBO明显抑制Bev导致的MMP9表达上调，提示MMP9 在HBO 抑制Bev 导致的U251 细胞侵袭性增强中发挥重要作用。

回顾性分析及荟萃分析显示HBO 可导致肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂增殖。本文结果显示，与单独HBO或Bev相比，二者联合应用使U251细胞的增殖能力明显下降，荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显缩小，存活时间明显延长，提示HBO 与Bev 联合应用，可产生协同效应，共同抑制GBM 生长。本文还发现，Bev可降低肿瘤组织MVD，但不能延长荷瘤裸鼠的存活时间，与临床应用Bev 治疗GBM 的结论一致。HBO 对肿瘤组织MVD 没有影响，联合应用Bev与HBO，与单独使用Bev 相比，肿瘤组织MVD 未见明显变化，但肿瘤体积缩小，荷瘤裸鼠存活时间明显延长，提示HBO增强Bev对胶质瘤细胞的抑制效果，与肿瘤组织内血管形成的关系不大，其中涉及的机制有待进一步研究分析。

既往研究显示，HBO 可增强化疗药物的敏感性，改善胶质瘤的放疗抗性，抑制胶质瘤干细胞增殖，并促进胶质瘤病人术后神经功能恢复，因此将HBO作为胶质瘤辅助治疗的方法，值得深入研究。

总之，HBO 可抑制Bev 导致的胶质瘤细胞侵袭性增强，又能增强Bev对胶质瘤细胞的抑制作用，将HBO与Bev联合应用，有助于增强Bev的治疗作用。