miR-126表达水平及其基因启动子甲基化状态与胶质母细胞瘤术后复发的关系

王艳新 叶富跃 王 艳

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常见和最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤[1]，即使采用手术联合术后放化疗，预后仍很差。因此，探讨其生物标志物对其临床诊治具有实际的临床意义。研究发现miR-126在多种肿瘤中表达失调[2]。本文探讨miR-126表达水平及基因启动子甲基化状态与GBM术后复发的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 纳入标准：①符合原发性GBM（WHO分级Ⅳ级）诊断标准[3]；②临床资料完整；③手术前后影像学资料完整，术前没有接受放疗或化疗；④均接受显微手术，术后常规综合治疗。排除合并其他恶性肿瘤或自身免疫性疾病、心力衰竭、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、肾衰竭。

收集2016 年8 月到2020 年12 月手术切除的石蜡包埋的GBM 组织标本86 例，其中男41 例，女45例；年龄25～83 岁，中位年龄51.0 岁；术前KPS 评分56～92 分，中位评分70.0 分。另选择颅脑损伤内减压术中切除非肿瘤脑组织30例，其中男15例，女15例；年龄23～85岁；中位年龄52.0岁。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 实时荧光定量PCR 法检测miR-126 水平 使用QIAamp DNA/RNA FFPE组织提取试剂盒（德国QIAGEN 公司）提取石蜡包埋组织基因组DNA/RNA[4]。将总RNA 样本依照RevertAid FirstStrand cDNA 合成试剂盒（美国Thermo Scientific 公司）和基因特异性环状引物进行逆转录反应，反应条件：将混合物在冰浴上孵育5 min，42 ℃60 min，70 ℃5 min。用ABI 7500 实时PCR 系统（美国Applied Biosystems 公司）进行PCR 扩增（扩增条件：94 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40次循环，反应体积25 μl）。用2-ΔΔCt法以β-actin 为内参计算miR-126 mRNA 的相对表达量。数据用RNU6 标准化。miR-126 正向引物5'-TGCCTCGTACCGTGAGTAC-3'，反 向 引 物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 miR-126 甲基化状态检测[4]①取1 μg 组织总DNA，使用EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold（北京中西远大科技有限公司）进行亚硫酸处理。用Wizard DNA 纯化树脂对修饰后的DNA 样本进行纯化。②取200 μg 修饰后DNA 样本进行甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）扩增。将PCR 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色观察。用Sssl 甲基化酶处理基因组DNA 作为甲基化DNA的阳性对照，用外周血单个核细胞DNA作为非甲基化基因的阳性对照。甲基化引物出现阳性扩增视为甲基化，否则为非甲基化。miR-126-M正向引物5'-TTG GCG GTC GGG TTT GGT C-3'，反 向 引 物5'-TAA AAC CCC GCG ACG AAC G-3'。miR-126-U正向引物5'-TTG GTT TTT GGT GGT TGG GTT TGG TT-3'，反 向 引 物5'-CAA ACA AAA AAA CTA AAA CCC CAC AAC AAA CA-3'。③变性高效液相色谱法检测：分别取8 μl miR-126-M 扩增产物和miR-126-U 扩增产物以分离方式置于DNASep 核酸分析柱（美国Transgenomic 公司）中，收集更多的片段。采用Navigator软件对结果进行分析（设置：碎片大小100～200 bp，分析温度50 ℃，流速0.9 ml/min，紫外检测波长260 nm）。

1.4 临床和影像学随访 术中观察肉眼全切除（Simpson 分级Ⅰ～Ⅱ级），次全切除（Simpson 分级Ⅲ级）。随访至2021 年3 月，随访时间2～56 个月，中位随访时间24.0 个月。术后72 h 内进行增强MRI 扫描，出院后前1 年每间隔3 个月、术后1～3 年每间隔6 个月、术后3年后每间隔1年，或出现如癫痫、神经功能障碍、颅内高压等症状时复查增强CT 或MRI，观察肿瘤情况。自术后至复查增强CT 或MRI 扫描时观察到新增强病灶的时间为复发时间。肿瘤复发包括原位复发、邻近部位复发或远隔部位复发。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0软件处理；定量资料用表示，用t检验；多因素Cox回归分析复发的危险因素；生存曲线分析miR-126 甲基化与术后复发时间的关系；绘制受试者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miR-126 水平预测术后复发的效能；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBM 组织miR-126 表达水平和甲基化状态 与非肿瘤脑组织相比，GBM 组织miR-126 表达水平明显降低（P＜0.05），同时基因甲基化率明显升高（P＜0.05）。见图1和表1。

图1 MSP-DHPLC法检测miR-126基因启动子的甲基化状态

表1 GBM组组织miR-126表达水平和甲基化水平状态

2.2 GBM组织miR-126表达水平和甲基化状态的关系 甲基化组GBM 组织miR-126 表达水平（0.530±0.139）明显低于未甲基化组（0.861±0.121；P＜0.05）。

2.3 GBM组织miR-126甲基化状态和术后复发的关系 术后58 例（67.44%）复发。与未复发组相比，复发组GBM 组织miR-126 表达水平明显降低（P＜0.05，表2），同时基因甲基化率明显升高（P＜0.05，表2）。生存曲线分析显示，miR-126 甲基化组中位复发时间（16.0个月）较非甲基化组（39.0个月）明显缩短（P＜0.05，图2）。

表2 miR-126水平和甲基化率与GBM复发的关系

图2 生存曲线分析miR-126甲基化状态与术后复发的关系

2.4 GBM术后复发的影响因素 单因素和多因素Cox回归分析显示，GBM组织miR-126甲基化和IDH1基因突变是GBM 术后复发的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 本文86例胶质母细胞瘤术后复发危险因素的Cox回归分析结果

2.5 GBM组织miR-126表达水平预测术后复发的价值ROC 曲线分析显示，GBM 组织miR-126 表达水平预测术后复发的曲线下面积为0.894（95% CI 0.837～0.950；P＜0.05），最佳截断值为0.830，灵敏度和特异度分别为90.0%和75.6%。见图3。

图3 ROC 曲线分析miR-126表达水平预测胶质母细胞瘤术后复发的效果

3 讨论

近年来，胶质瘤的治疗方法取得了一定的进步，包括手术、放化疗等，但是GBM病人3年内病死率仍然超过90%，这与术后复发关系密切[5]。为了预测GBM的临床病程，需要更清楚地了解引起术后复发的生物学因素。本文发现GBM 组织miR-126 表达水平明显下调，这与miR-126 基因启动子区域发生超甲基化有关；而且miR-126甲基化是导致GBM术后复发的独立危险因素。

miRNA 是一种小的非编码RNA，调控多种mRNA 转录和转录后翻译过程。miR-126 是一种可调节人巨核细胞生成的miRNA，并且在各种恶性肿瘤中普遍下调，因此，被认为是一种潜在的肿瘤抑制因子。有报道称miR-126是内皮细胞生物学和肿瘤血管生成的重要参与者，是肿瘤发展的标志性事件[6]。Chen 等[7]发现高度恶性胶质瘤组织和U87MG 细胞miR-126 的表达普遍低于正常脑细胞；miR-126表达上调后，U87MG 细胞的增殖、迁移和侵袭活性则受到明显抑制，凋亡率明显增加；这与靶向抑制PTEN/PI3K/AKT 通路和MDM2-P53 途径有关。Xu等[8]通过转染miR-126 mimics 后发现，U87 和U251细胞的迁移能力明显降低。本文发现GBM 组织miR-126 表达水平较非肿瘤脑组织普遍降低，尤其是复发组降低水平更明显。这提示miR-126有望成为GBM诊断、治疗和预后的新型生物标志物。

肿瘤细胞miRNA 的表达受到包括DNA 甲基化修饰在内的表观修饰等多种机制的调控，而GBM具有广泛的遗传和表观遗传学异质性。表观遗传调控基因的突变已被确定为具有明显临床特征的神经胶质瘤亚型的关键驱动因素。Klughammer 等[9]报道原发性和复发性GBM 相匹配的DNA 甲基化的基因组图谱，从而确定了DNA 甲基化和肿瘤复发、病人生存预后之间的联系。表观遗传学的改变，如DNA启动子区CpG 岛的甲基化状态，被认为是肿瘤早期和常见的事件，并在肿瘤进展中发挥重要作用。本文发现与非肿瘤脑组织相比，GBM 组织miR-126 基因异常甲基化率升高，这是导致miR-126 表达水平降低的重要原因之一。Verhaak等[10]基于TCGA数据库分析GBM 基因序列突变谱，并确认TP53、EGFR、IDH1、PIK3R1、BRAF V600E、PTEN 等相关突变，大多数GBM 存在这些基因或信号通路异常情况。这提示这些分子可能是GBM 发生、发展的关键分子。本文结果显示miR-126 基因甲基化和IDH1 基因突变是影响GBM 术后复发的独立危险因素。这提示miR-126基因甲基化和IDH1基因突变一样，都是与GBM复发相关的一个重要表观遗传学事件。

综上所述，GBM 组织miR-126 表达水平普遍降低，这与其基因启动子异常甲基化有关；miR-126基因高甲基化是GBM术后复发的独立危险因素，对预测病人预后有一定的作用。