血浆外泌体miR-212、miR-132与颅脑损伤严重程度和Rotterdam CT评分的关系

龚铭杰 黄 炜 施振华 王君祥

颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是目前导致成年人群意外死亡的主要原因之一[1]。颅脑CT是临床诊断TBI的基础。Rotterdam CT评分对预测TBI预后有一定的临床价值[2]。炎症反应是导致TBI 继发性损伤的机制之一[3]。外泌体微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可以通过模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）参与炎症反应[4，5]。研究发现miR-212/132 在中枢神经系统中呈高度表达，与突触可塑性、记忆形成和神经突生长有关[6]。本文探讨血浆外泌体miR-212、miR-132 水平与TBI病人损伤程度和Rotterdam CT评分的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性收集2019 年3 月～2020 年10月收治的TBI 共76 例，其中男43 例，女33 例；年龄18～79 岁，平均（48.70±14.32）岁；交通事故伤36 例，高空坠落伤18例，异物打击伤9例，其他原因13例；轻型19例，中型35例，重型22例。排除合并阿尔茨海默病、帕金森病、脑部肿瘤或其他器质性脑综合征等以及酗酒或滥用药物病人。另外，选取我院体检38例健康成年人作为对照，其中男21例，女17例；年龄18～78 岁，平均（49.80±15.91）岁。本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 血浆外泌体miR-212、miR-132 的检测 收集全血样本，2 h 内以3 000 转/min 离心10 min（4 ℃），收集血浆-80 ℃保存备用。血浆解冻后，3 000 转/min离心5 min，去除循环细胞或碎片。取上清液50 μl，加入外泌体提取试剂10 μl，4 ℃孵育30 min，然后室温1 000 g离心10 min，使用缓冲液重悬沉淀，得到血浆外泌体。使用电镜观察外泌体提取情况。免疫印迹法鉴定外泌体表面特异性抗原表达[7]。

取200 μl 血浆外泌体样本，用TRIzol 试剂提取总RNA，PrimeScript First-Strand cDNA 合成试剂盒（日本Takara公司）逆转成cDNA。取2.0 μl的cDNA模板和cDNAs PrimeScript RT Master Mix 试剂盒（日本Takara 公司）进行PCR 反应：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、1 min，40 个循环。miR-212正向引物5'-GGCACCTTGGCTCTAGACTG-3'，反向5'-GTCGGTGGCCGTGACTG-3'。miR-132 正 向 引物5'-CGACCATGGCTGTAGACTGT-3'，反 向5'-GTCTCCAGGGCAACCGTG-3'。U6 和18S rRNA 作为内源性对照。用2-△△CT法计算相对表达量。

1.3 Rotterdam CT 评分 入院进行脑部CT扫描，用于Rotterdam CT 评分[8]。初始CT 图像通过医学图像归档和通讯系统进行复阅，并由2位专家独立完成Rotterdam CT 评分：①基底池受压程度；②中线偏移度；③硬膜外血肿；④脑室内或蛛网膜下腔出血。

1.4 统计学方法 应用SPSS 21.0软件分析；正态分布计量资料以表示，采用t检验；非正态分布计量资料采用Mann-Whitney U；计数资料采用χ2检验；采用相关系数分析相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定结果 电镜观察外泌体呈圆形、椭圆形，具有完成的双层脂质包膜结构，直径在50～120 nm。免疫印迹法检测发现CD9、CD63 和CD81膜蛋白表达阳性。见图1。

图1 血浆外泌体的鉴定

2.2 TBI 病人血浆外泌体miR-212、miR-132 的变化与对照组比较，TBI 组血浆外泌体miR-212、miR-132水平明显降低（P＜0.001，表1）。

表1 TBI病人血浆外泌体miR-212、miR-132水平变化

2.3 TBI 病人血浆外泌体miR-212、miR-132 水平与损伤严重程度的关系 与轻型TBI比较，中、重型TBI组血浆外泌体miR-132 水平明显降低（P＜0.05，表2）；与中型TBI比较，重型TBI血浆外泌体miR-212、miR-132水平明显降低（P＜0.05，表2）。血浆外泌体miR-212（r=0.396）、miR-132（（r=0.716）水平与入院GCS评分呈明显正相关（P＜0.001）。

表2 TBI 病人血浆外泌体miR-212、miR-132 水平与损伤严重程度的关系

2.4 TBI 病人血浆外泌体miR-212、miR-132 水平与Rotterdam CT评分的关系 血浆外泌体miR-212水平（r=-0.375）和miR-132 水平（r=-0.613）与Rotterdam CT评分呈明显负相关（P＜0.05）。

3 讨论

TBI 的脑损伤包含两个过程：急性损伤以及急性损伤结束后的慢性期（包含神经炎症、氧化应激、神经细胞凋亡等过程）。TBI 后，小胶质细胞被激活，释放多种活性物质，包括外泌体[9]。外泌体具有较低的免疫原性，可以穿透多种生物屏障，同时携带大量的特异性分子，为体内的“通讯使者”[10]。研究表明，外泌体含有大量miRNA，为TBI的潜在生物标志分子[11]。动物实验发现，miR-212/132在大脑中呈普遍高表达，其靶基因（PDCD4、Ptgs2 等）可通过影响内皮祖细胞的再生、影响血脑屏障、树突形态以及胶质细胞的分化等过程参与神经系统疾病的发生[12]。miR-212、miR-132 都位于人类17 号染色体，具有一定的同源性，可以共同调控下游靶基因。Burek等[13]研究发现miR-212/132可抑制紧密连接蛋白，改变低氧条件下血脑屏障的通透性。Xu 等[14]发现，神经元分泌含miR-132的外泌体对维持脑血管的完整性具有重要作用。

Rotterdam CT 评分是临床应用比较广泛的评分系统，包含对中线移位、中脑基底池受压、颅内出血的位置等多个影像学特征的评估，这些指标与颅内压升高密切相关。基底池的受压程度是预测TBI病人预后的重要因素，初次CT检查时脑池缺失或不可见的病人，预后不良风险增加近4倍[15]。显著的中线移位是TBI 手术治疗的指征，中线移位还与许多神经后遗症有关，中线移位是临床评估TBI 严重程度的重要参数[16]。中线移位＞5 mm 的病人，手术的风险增大[17]。Rotterdam CT 评分还包含对脑出血情况的评估。李浩浩等[18]研究表明Rotterdam CT 评分增加与TBI 预后不良有关。我们发现TBI 病人血清外泌体miR-212、miR-132水平与Rotterdam CT评分呈明显负相关，提示血清外泌体miR-212、miR-132 水平在一定程度上反映TBI 病人的脑部影像学特征。此外，术前GCS 评分也与TBI 病人的预后显著相关[19]。本文结果显示TBI 病人血清外泌体miR-212、miR-132 与术前GCS 评分呈明显负相关。随着TBI病情的加重，血浆外泌体miR-132、miR-212 水平明显降低。因此，我们认为，血清外泌体miR-212、miR-132水平不仅能反映TBI病人脑部CT影像学特征，同时对病人短期预后预测也具有一定价值。

综上所述，TBI 病人血浆外泌体miR-132、miR-212 水平明显下降，并且随着TBI 损伤程度加重和Rotterdam CT 评分增加而随之降低。这提示血浆miR-132、miR-212可能是TBI潜在的生物标记物。