BC@Laccase消减材料优化制备及其去除水体中2-氯苯酚性能评价

陈 杰 杨 云 胡雪怡 张 勇 龚 宇

（1.上海策安能源科技有限公司，上海，201822；2.浙江理工大学材料科学与工程学院，浙江杭州，310018；3.生态环境部核与辐射安全中心，北京，100082）

随着我国工业经济的快速、稳健发展，由此引发的环境污染问题也伴随产生；其中，由工业废水超标排放引起的水环境污染尤为突出。制浆造纸工业是工业废水产生与排放大户，废水排放量占我国工业废水排放总量的20%～30%[1]。纸浆漂白是造纸废水的主要产生工段，是制浆造纸工业水污染控制的关键环节。

含氯漂白是我国制浆造纸工业在纸浆漂白工段应用最广泛的工艺过程，具有低价高效、技术成熟等优势[2]。在传统氯漂过程中，纸浆中木素被氯气、次氯酸盐等含氯漂剂碎解、溶出，具有苯环结构的酚类木素碎片在漂白废水中与残余氯元素结合[3]，易生成氯酚类持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，简称POPs），具有高毒性、持久性、生物积累性、远距离迁移性[4]等特点，对人体健康和生态环境造成危害。2-氯苯酚是其中重要的一类POPs 污染物[5]，已被我国列为POPs中优先控制污染物。

漆酶（Laccase）是一种多组分氧化酶，能氧化酚类、氯酚类、芳香胺类及一些无机化合物[6]，其在处理水体污染物中表现出操作简单、催化效率高且无二次污染等显著优点[7]，可作为绿色催化剂用于水处理[8]、染料脱色[9]和土壤生物修复[10]等方面。但是，游离形式的漆酶存在较多局限性，如稳定性差、重复利用率低、运行成本高[11]等。为了克服这些缺点，可采用固定化技术，通过固定酶提高漆酶的稳定性和重复利用率，降低处理成本。

细菌纤维素（BC）是由特定细菌产生的一种独特形式的纤维素，具有良好的机械性能、超细微的三维网状结构和优异的吸水能力[12-13]，可考虑将其作为固定漆酶的载体。同时，介体能够有效提高漆酶的催化效率。这类介体易得失电子，迅速被漆酶氧化成活性高且稳定的中间体，作用于底物使其被催化氧化[14]。

为此，基于2-氯苯酚的环境危害、漆酶的催化优势以及BC 的载体特性，本研究以2-氯苯酚模拟水体中的POPs 污染物，以芥子酸作为漆酶介体，通过酶固定化技术将漆酶固定于BC，优化制备经BC 固定漆酶的BC@Laccase 消减材料，评价BC@Laccase 消减材料对水体中2-氯苯酚的降解和消除能力。

1 实 验

1.1主要试剂

醋酸杆菌CGMCC 1.1812 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；葡萄糖（AR）、酵母浸粉（UP）、柠檬酸钠（纯度98%）、硫酸镁（AR）、醋酸钠（AR）、冰乙酸（AR）、戊二醛（AR）、2-氯苯酚（AR）、4-氨基安替比林（98%）、氯化铵（AR）、芥子酸（纯度98%）均购自上海阿拉丁化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（AR）购自上海三鹰化学试剂有限公司；蛋白胨（BR）、磷酸氢二钠（AR）、氢氧化钠（AR）、乙酸钠（AR）、氨水（AR）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，纯度98%）、铁氰化钾（AR）均购自上海麦克林生化科技有限公司；漆酶（PP）购自盈芯生物科技（上海）有限公司。

1.2实验仪器

Nicolet 5700 傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR），美国Thermo Scientific 公司；F1-TGA 209-Libra 热重分析仪（TGA），德国Netzsch 公司；S-4800 场发射扫描电子显微镜（FESEM），日本Hitachi 公司；雷磁pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3BC基材培养

将醋酸杆菌置于种子培养基（30 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、1 g/L柠檬酸钠、2 g/L硫酸镁）中，在28℃下，以140 r/min 转速搅拌动态培养36 h；按10%接种量转接至发酵培养基（30 g/L 葡萄糖、12 g/L酵母浸粉、12 g/L蛋白胨、2 g/L柠檬酸钠、2 g/L 硫酸镁、2.7 g/L 磷酸氢二钠、2 g/L 磷酸二氢钾），28℃静态培养7 天。上述种子培养基和发酵培养基置于高压灭菌锅中120℃灭菌20 min，经冷却后使用。

将发酵培养基表面悬浮BC 膜取出，清水缓慢冲洗，去除膜表面菌体及残留培养基成分；置于0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，70℃水浴至BC 膜呈白色半透明状取出；去离子水冲洗后置于1%乙酸中浸泡10 min，用去离子水反复冲洗至中性；将其置于超低温冰箱中预冷冻4 h，放入冷冻干燥机中冷冻48 h，得到BC 干膜，即固定漆酶用BC基材。

1.4BC@Laccase消减材料优化制备

将10 mg BC 基材浸入2 mL质量分数2.5%戊二醛溶液中，搅拌1 h 使其充分反应；将其置于10 mL 漆酶溶液（0.5 mg/mL）中，一定温度下温育20 min；于4℃静置吸附一段时间。研究固定时间、固定温度及环境pH 对制备的BC@ Laccase 消减材料酶活的影响。

1.5BC@Laccase消减材料分析表征

1.5.1表观形貌分析

将BC基材和BC@Laccase 消减材料置于导电胶上镀金，工作电压3 kV，通过FESEM 观察BC 基材及BC@Laccase消减材料的表观形貌。

1.5.2红外光谱分析

采用FT-IR 分析BC 基材和BC@Laccase 消减材料的化学结构，扫描范围500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.5.3热稳定性分析

采用TG 分析游离漆酶及BC@Laccase 消减材料的热稳定性，在N2气氛保护下以10℃/min 升温速率从常温升至600℃。

1.6BC@Laccase消减材料降解性能评价

将BC@Laccase消减材料置于2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L）中，在200 r/min转速下搅拌降解一段时间，通过改变介体用量、降解温度、pH 值及降解时间确定最优的降解工艺及效果。采用4-氨基安替比林法，于最大吸收波长510 nm 处测定2-氯苯酚的吸光度，经换算计算其降解率。

2 结果与讨论

2.1BC@Laccase消减材料优化制备

2.1.1固定时间

固定时间对制备的BC@Laccase 消减材料酶活的影响，结果如图1(a)所示。由图1(a)可知，12 h 内，游离Laccase 相对酶活保持稳定。BC@Laccase 消减材料的相对酶活随着固定时间的增加呈现出先升高后下降的趋势，固定时间在6 h 内，相对酶活较高，在82%以上；当固定时间超过6 h，相对酶活开始持续下降；可能是因为随着固定时间的延长，BC 基材上的吸附位点逐渐被占据，相关位阻和扩散限制导致其相对酶活降低。

2.1.2固定温度

固定温度对制备的BC@Laccase 消减材料酶活的影响如图1(b)所示。由图1(b)可知，随着固定温度不断上升，游离Laccase 和BC@Laccase 消减材料的相对酶活均呈现出先升高后下降的趋势；在25℃达到最大值98.3%，表现出最佳固定效果。当固定温度低于25℃，游离Laccase 活性受到抑制，相对酶活较低；当固定温度高于25℃，由于Laccase 氨基酸可能发生特异性突变，导致游离Laccase 失活量增加，相对酶活降低[15]。同时，发现由于游离Laccase 被固定后其空间结构发生变化，温度对BC@Laccase 活性的影响小于游离Laccase。

图1 固定工艺条件对BC@Laccase消减材料酶活的影响Fig.1 Influence of immobilizing conditions on enzyme activity of BC@Laccase

2.1.3环境pH值

图1(c)为环境pH 值对BC@Laccase 消减材料酶活的影响。由图1(c)可知，在pH 值3.5时，BC@Laccase消减材料相对酶活达到最大值98.5%，表现出最佳固定效果。随着环境pH 值继续增大，相对酶活快速下降，这可能与Laccase 周围支撑微环境和载体表面产生的质子有关[16]。而由于BC 基材孔道内部的微环境与外界环境存在的一定差异，固定化可对孔道内pH起到一定的缓冲作用，因此BC@Laccase 比游离Laccase的pH稳定性更强。

综上所述，BC@Laccase 消减材料最佳制备工艺条件为：固定时间4 h，固定温度25℃，环境pH值3.5。

2.2BC@Laccase消减材料分析表征

2.2.1表观形貌观察

通过FESEM 对BC 基材和BC@Laccase 消减材料的表观形貌进行观察，见图2。由图2(a)可以看出，BC 基材表面纤维相互缠结形成精细的网状结构，纤维丝层层交织形成三维网络，纤维之间存在大量空隙，允许纳米物质进入。这一结构特点使其具有较高的比表面积和良好的透气、透湿性，适宜作为Laccase 固定载体。在图2(b)中，由于Laccase 尺寸较小，BC@Laccase 消减材料的大部分Laccase 粒子可以吸附在BC表面或贯穿于基材网络中。由于BC基材的纳米结构具有非常精细和相互连通的纤维网络，Laccase能在其上均匀分布，较适宜作为Laccase 的固定基材。

图2 BC基材和BC@Laccase消减材料的FESEM图Fig.2 FESEM images of BC substrate and BC@Laccase

2.2.2FT-IR分析

BC 基材和BC@Laccase 消减材料的FT-IR 如图3所示。从图3 可以看出，对于BC 基材，3403 cm-1和2899 cm-1处存在O—H 和C—H 拉伸振动，1651 cm-1处出现特征峰，代表纤维素的葡萄糖羰基(C—O)[17]。对于BC@Laccase 消减材料，在1420 cm-1和1363 cm-1处出现了2 个重要的特征峰，分别代表C—H 的对称变形和弯曲振动[18]；1057 cm-1处是葡萄糖环中的骨架—C—O—C—特征峰，897 cm-1处是纤维素骨架中的β-1,4-糖苷键；1668 cm-1处出现的酰胺键是蛋白质的特征结构，表明Laccase已被成功固定在BC基材上。

图3 BC基材、游离Laccase和BC@Laccase消减材料的FT-IR谱图Fig.3 FT-IR spectra of BC substrate,free Laccase and BC@Laccase

2.2.3热稳定性分析

图4 为游离Laccase 和BC@Laccase 消减材料的TGA 图。由图4 可以看出，在100℃之前，游离Laccase 最先开始分解，主要是其本身含有的水分先流失。游离Laccase 和BC@Laccase 消减材料主要在250～400℃范围内进行热分解；游离Laccase 的开始分解温度为250℃，BC@Laccase 消减材料开始分解温度为300℃；游离Laccase 的最大热降解温度在330℃，BC@Laccase 消减材料的最大热降解温度在380℃。这是因为分解温度低于250℃时，主要是纤维素分子内的结晶区受到破环，使其先分解；分解温度高于250℃时，主要是酰胺键在一定程度上增加其稳定性，使其分解温度增高，表明BC@Laccase 消减材料热稳定性明显高于游离Laccase。

图4 游离Laccase和BC@Laccase消减材料的TGA图Fig.4 TGA curves of free Laccase and BC@Laccase

2.3酶学特性分析

米氏常数（Km）是酶的动力学参数，等于酶促反应最大反应速度1/2 时的酶浓度。Km值可反映酶与底物的亲和力大小，Km值越小，酶与底物的亲和力越大。在底物浓度0.2～1 mmol/L ABTS 溶液中，将适量游离Laccase 和BC@Laccase 消减材料分别与ABTS 溶液反应5 min，420 nm 处测定吸光度变化值，计算酶促反应的初速度V，由Lineweaver-Burk 双倒数处理，结果如图5 所示。由图5 得出，游离LaccaseKm值为1.018 mmol/L，BC@Laccase 消 减 材 料Km值 为1.086 mmol/L。Laccase 被固定后Km值增大，Laccase 与BC基材间的亲和力降低，这主要是由于Laccase 被固定后空间位阻增大，BC 基材与Laccase 活性中心的接触机率变小所致。

图5 游离Laccase和BC@Laccase消减材料的Lineweaver-Burk双倒数图Fig.5 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of free Laccase and BC@Laccase

2.4降解2-氯苯酚性能评价

2.4.1介体用量

选定芥子酸作为BC@Laccase 消减材料的催化介体，在降解温度30℃、pH值6、降解时间4 h条件下，研究芥子酸用量对BC@Laccase 消减材料催化降解水体中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解性能的影响，如图6(a)所示。由图6(a)可知，BC@Laccase 消减材料催化降解2-氯苯酚性能随芥子酸用量的增加呈先升高后降低趋势。当芥子酸用量在4 mmol/L时达到最佳降解效果，2-氯苯酚降解率达66.3%。

2.4.2降解温度

在芥子酸用量4 mmol/L、pH 值6、降解时间4 h的条件下，研究降解温度对BC@Laccase 消减材料催化降解水体中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解的影响，结果如图6(b)所示。当降解温度为25～30℃时，BC@Laccase 消减材料对2-氯苯酚的降解率呈上升趋势；当降解温度为30～45℃时，降解率开始逐渐下降；降解温度为30℃时，2-氯苯酚降解率最高达到76.4%。此外，BC@Laccase 消减材料在25～45℃的较宽温度范围内对2-氯苯酚的降解率均在73.0%以上，主要是由于Laccase 被固定后其空间结构发生变化，降解温度对固定Laccase催化性能的影响变弱。

2.4.3环境pH值

在芥子酸用量4 mmol/L、降解温度30℃、降解时间4 h 条件下，研究环境pH 值对BC@Laccase 消减材料催化降解水体中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影响，如图6(c)所示。由图6(c)可知，当pH 值＜3时，BC@Laccase 消减材料的降解性能逐渐增强；当pH 值＞3 时，降解能力迅速降低；当pH 值=3 时，BC@Laccase 消减材料对催化降解2-氯苯酚效果最佳，降解率达到63.3%。

图6 降解条件对BC@Laccase消减材料催化降解水体中2-氯苯酚性能的影响Fig.6 Effect of degradation conditions on the catalytic degradation of 2-chlorophenol in water by BC@Laccase materials

2.4.4降解时间

在芥子酸用量4 mmol/L、降解温度30℃、pH 值3的条件下，研究降解时间对BC@Laccase 消减材料催化降解水体中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影响，如图6(d)所示。由图6(d)可知，当降解时间为1～5 h 时，BC@Laccase 消减材料对2-氯苯酚的降解能力逐渐增强；当降解时间为5～6 h 时，降解性能出现急剧下降，这可能是由于固定Laccase 在对2-氯苯酚降解过程中底物浓度的减少导致，降解产物的累积也会抑制2-氯苯酚的催化降解。当降解时间为5 h 时，BC@Laccase 消减材料对2-氯苯酚降解性能最佳，降解率为76.9%。

2.5循环使用性能

取10 mg BC@Laccase 消减材料在芥子酸用量4 mmol/L、降解温度30℃、pH 值3、降解时间5 h 的条件下，催化降解2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L），测定其溶液吸光度。使用BC@Laccase 消减材料后，通过缓冲溶液多次冲洗，重复上述操作，BC@Laccase消减材料循环使用对2-氯苯酚溶液降解率的影响如图7 所示。由图7 可知，经过7 次循环操作，BC@Laccase 消减材料对2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，降解率仍保持在65.0%以上，表现出较好的循环使用性能。

图7 BC@Laccase消减材料催化降解2-氯苯酚的循环使用性能Fig.7 Recycling performance of BC@Laccase on catalytic degradation of 2-chlorophenol

3 结论

以超细微三维网状结构细菌纤维素（BC）作为固定漆酶（Laccase）支架，通过戊二醛交联将漆酶固定于BC 基材上，制备环境友好、安全高效的BC@Laccase 消减材料，应用于水体中2-氯苯酚的催化降解。

3.1经过单因素优化得到BC@Laccase 消减材料的最佳制备工艺条件为：固定时间4 h、固定温度25℃、环境pH 值3.5；与游离漆酶相比，BC@Laccase 消减材料在较宽的温度和pH 值范围内可保持较高酶活，具有良好的稳定性。

3.2场发射扫描电子显微镜表明，漆酶吸附于BC基材表面并贯穿于其内部网络，BC@Laccase 消减材料的FT-IR 谱图出现新酰胺键特征峰，表明漆酶与BC基材主要通过酰胺键结合并固定。

3.3游离漆酶的米氏常数（Km）值为1.018 mmol/L，BC@Laccase 消减材料Km值为1.086 mmol/L，较游离漆酶有所增大，漆酶与BC基材间的亲和力降低。

3.4当芥子酸用量4 mmol/L、降解温度30℃、环境pH值3、降解时间5 h时，BC@Laccase 消减材料催化降解水体中2-氯苯酚能力最强，降解率达到76.9%。

3.5经过7 次循环使用后，BC@Laccase 消减材料对2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，表明BC@Laccase 消减材料具有较好循环使用性能。