TIMP2 和IGFBP7 的生物学功能及其在肾脏损伤过程中作用的研究进展

张 杨 （综 述） 王一梅 姜物华 赵 栓 丁小 强 △（审 校）

（1复旦大学附属中山医院肾内科 上海 200032；2上海市肾病与透析研究所 上海 200032；3上海市肾脏疾病与血液净化重点实验室 上海 200032）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指肾脏功能在短期内恶化（以肾小球滤过率快速下降为特点）的一组以代谢废物毒素蓄积、体液潴留、电解质酸碱平衡紊乱等为特征的临床综合征。根据全球AKI 流行病学Meta 分析显示，成年住院患者发病率为21.6%，病死率为23.9%。儿童住院患者发病率高达 33.7%，病死率为 13.8%［1］。2015 年我国一项2 223 230 例的多中心临床调查显示，AKI 住院病死率为12.4%，另有16.1%的住院患者出院时仍有严重AKI，高达74.2%的AKI 患者住院期间未被诊断，而被诊断的患者中有17.6%诊断滞后［2］。目前对AKI 仍然没有有效的治疗方法，主要原因在于AKI 发病原因复杂，难以精确预测或早期诊断。

生物标志物是临床预测和诊断AKI 的重要指标，主要包括血肌酐、尿素氮、尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、肾 损 伤 分 子 1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、尿 IL-18、金属蛋白酶组织抑制因 子 2（tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP2）和胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7，IGFBP7）等［3］。其 中 ，尿 液 TIMP2 和 IGFBP7 浓 度 的 乘 积（［TIMP2］·［IGFBP7］）在 AKI 早期显著升高，因此在预测 AKI 发生方面优于其他标志物［3］。［TIMP2］·［IGFBP7］在危重患者及心脏手术后患者AKI 风险预测中表现良好［4-6］，同时该指标能很好地预测脓毒血症 AKI 患者的预后结局［7］，且一般合并症（如糖尿病、充血性心力衰竭、慢性肾脏病）不会影响这一指标对 AKI 的风险评估［8］，其在 2014 年被 FDA 批准用于 AKI 的临床预测。但是，TIMP2 和 IGFBP7 的生物学功能是什么，TIMP2 和IGFBP7 为何能够预测AKI 的发生，二者在正常以及损伤后的肾脏中有何作用等问题都尚未明确。因此本文通过分析TIMP2 和IGFBP7 所属蛋白家族的特点及已报道的生物学功能，对TIMP2 和IGFBP7 在肾脏中除生物标志物之外的作用和功能进行深入解析。

TIMP2 的生物学特征和功能

TIMPs 家 族 与 TIMP2 TIMP2 属 于 TIMPs 家族，该家族由4 个成员组成（TIMP1~4），为内源性基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的抑制因子。各成员对MMPs 的抑制能力和范围存在差异，TIMP3 的抑制作用最广泛，TIMP2 其次，而 TIMP1 范围最窄（表 1）。TIMPs 通过调控MMPs 的活性调节细胞外基质的代谢、组织的重塑和细胞行为等生物过程；还通过非MMP 依赖性途径参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移、血管形成等生命过程，例如TIMP2/3 具有调节细胞凋亡的作用［9］。

表1 人TIMP 家族成员的生物学功能简介Tab 1 Biological functions of the human TIMPs

在基因组中，TIMP1、3 和 4 的编码基因与突触相关蛋白编码基因的内含子存在部分重合，而编码TIMP2 的 基 因 与 编 码 DDC8（differential display clone 8）基因部分重合。DDC8 在睾丸等组织中表达，与TIMP2 共同参与精子生成、脑皮质损伤修复等过程［10］。

TIMP2 的蛋白结构及表达部位 人TIMPs 蛋白由 N 端和 C 端结构域组成［11］：N 端中间区域的氨基酸序列极为保守，是结合 MMPs 的主要部位［12］；C端结构域则在pro-MMP2 激活过程中起重要作用［13］。TIMP2 在正常机体内的多个器官中表达，多表达于生殖系统及膀胱中，而肾脏中较少［14］。

TIMP2 对细胞增殖的影响及机制 TIMP2 能够促进细胞增殖。在细胞质中，TIMP2 的C 端结构域与MMP2 前体（pro-MMP2）结合形成复合物，在MMP14 的作用下成为成熟的 MMP2［13］。TIMP2 同时对MMP2 活性具有抑制作用，这受到细胞膜中TIMP2、细胞外基质以及MMP14 三者含量的调控［9］。研究发现 TIMP2 通过激活蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）及 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号途径促进细胞生长［15］。游离在细胞外的TIMP2 通过结合细胞表面的MMP14，激活细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），促进细胞生长［16］。在肺腺癌中，TIMP2 通过 c-Src 激酶的活化，激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）、PI3K/AKT、ERK1/2 通路，促进肿瘤细胞增殖［17］。TIMP2基因敲除小鼠表现为中枢神经系统和肌生成缺陷，如神经元分化延迟、运动系统功能异常、肌力降低等［9］。

另一方面，TIMP2 具有抑制细胞增殖的功能。TIMP2 通过结合内皮细胞表面的 α3β1整合素，抑制血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）的激活，同时激活腺苷酸环化酶，增加细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，激活含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase-1，SHP-1），使 VEGF/FGF 受体去磷酸化［9，18］。TIMP2 通过促进 p27Kip1的合成进而抑制 CDK4（cyclin-dependent kinase 4）和CDK2，最 终 使 内 皮 细 胞 周 期 停 滞 于 G1 期［18］。TIMP2 通过抑制细胞周期蛋白B 和D 的表达，促进CDK 抑制因子p21Cip的生成，抑制神经元细胞进入细胞周期，促进细胞分化［19］。TIMP2 还可以通过抑制 Wnt （wingless-type MMTV integration site family）/β-catenin 通路来抑制肿瘤细胞的增殖［20］。除通过上述MMP 非依赖机制外，TIMP2 还可以通过抑制MMPs 调节细胞外基质，抑制血管内皮细胞增殖，进而抑制血管形成［9，18，21］。

TIMP2 在肾脏中的作用及其机制 TIMP2 参与肾脏发育过程。输卵管芽通过分泌TIMP2 抑制MMPs 的活性，导致细胞外基质沉积，从而抑制输尿管芽的生长。胶质细胞系来源的神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor 7，FGF7）在肾脏发育早期通过促进输尿管芽分泌TIMP2，抑制肾间充质干细胞的凋亡［22］。

TIMP2 参与肾脏免疫调节过程。在脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞损伤以及AKI 小鼠模型中，下调TIMP2 可以抑制p65 磷酸化，进而抑制NFκB（nuclear factor kappa B）通路，减少细胞因子释放和细胞凋亡，因而TIMP2 下调在内毒素引起的AKI 中对肾脏具有保护作用［23］。研究发现，在缺血或甘油诱导的肾损伤小鼠模型中，尿液TIMP2、IGFBP7 含量明显上升，但肾脏中TIMP2 和IGFBP7 的 mRNA 水平并未增加，因而 AKI 发生时肾小管滤过增加、重吸收减少使近曲小管TIMP2 和IGFBP7 分泌量增加，而并非由TIMP2 和IGFBP7表达量增加所致［24］。

IGFBP7 的生物学特征和功能

IGFBPs 家族与IGFBP7 胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）的结构与胰岛素相似，具有有丝分裂原的作用，可调控细胞增殖和代谢。根据与IGF的亲和性，IGF结合蛋白（IGF binding protein，IGFBP）超家族主要分为高亲和性的IGFBP1~6 和低亲和性的IGFBP 相关蛋白（IGFBP-related protein，IGFBP-rP），IGFBP7 属于后者［25］。

IGFBPs 结构和功能 传统意义上的IGFBPs（IGFBP1~6）富含半胱氨酸，由 N 端、中间区域、C端这3 个结构域组成。其中N 端、C 端高度保守，中间区域具有可变性。N 端含有一段极为保守的“GCGCCXXC”氨基酸序列，与 IGF 亲和力有关［26-29］。

IGFBP 作为 IGFs 的转运蛋白，调节 IGFs 的功能与活性，延长IGFs 在体液中的半衰期。IGFs 若被定位在细胞膜上，IGFBP 募集则有助于与IGF 受体结合，而若被胞外游离的IGFBP 结合则不利于与IGF 受体结合［30］。这些作用通过 IGFBP 中间区域的磷酸化［31］和IGFBP 蛋白酶降解等机制进行调节。IGFBP 可以直接通过调节细胞分泌生长因子、与细胞表面非IGF 受体直接作用、入核调控基因转录以及鞘磷脂作用途径等多种机制调控细胞凋亡、增殖、存活、衰老和自噬等过程［32-34］。

IGFBP-rP 在结构和功能上与IGFBP1~6 类似，因此也被列入IGFBP 家族。IGFBP-rP 具有保守的N 端结构域，但是缺少C 端结构域和中间结构域，虽然能够结合IGF 但亲和力比IGFBP1~6 低，因而被称为IGFBP-rP。成员包括IGFBP7、结缔组织 生 长 因 子（connective tissue growth factor，CTGF）、IGFBP-rP3 和 IGFBP-rP4［35-38］等。

IGFBP7 的分布 IGFBP7 分布非常广泛，在外周神经、平滑肌细胞（包括血管壁、消化道、膀胱、前列腺）、呼吸系统纤毛、附睾以及输卵管中都有较强的免疫荧光染色，各脏器中肾脏表达最多［14］。几乎所有的上皮细胞都有不同程度的IGFBP7 表达，在血浆、尿液、羊水、脑脊液等体液中IGFBP7 均可被检测到［39］，但脂肪细胞、浆细胞和淋巴细胞内没有表达。肾脏中IGFBP7 在不同细胞类型中的分布不同，其中肾小球表达量最低，远曲小管中的表达高于近端小管［40］。也有研究发现IGFBP7 在近端小管表达较强，并且定位在部分近曲小管的刷状缘［41］。

IGFBP7 的结构 IGFBP7 的 N 端结构 域具有IGFBP 家族特点，含有“GCGCCXXC”肽段，而 N 端结构域之外的序列与IGFBP 家族其他成员的同源性仅为15%［25］。近N 端有一段氨基酸序列与Kazal家族丝氨酸蛋白酶相似，称为KI（Kazal-type serine proteinase inhibitor）结构域［25］，这段序列还与卵泡抑素高度同源。KI 结构域之后的序列与成纤维细胞生长因子受体中的免疫球蛋白样结构类似，该序列与硫酸乙酰蛋白肝素具有同源性［42］（图1）。传统IGFBP 与IGF 的结合需要N 端和C 端结构域共同参与。由于 IGFBP7 缺少 C 端结构域，IGFBP7 与IGF 的亲和力仅为传统 IGFBPs 的 1%［43］。C 端结构域的缺失还造成N 端结构域中的胰岛素结合位点暴露［44］（图 2），因而 IGFBP7 与胰岛素的亲和力比IGFBP 家族其他成员更强。综上，IGFBP7 可能通过非IGF 途径发挥生物学功能。

图1 IGFBPs 和IGFBP-rPs 的构成与简化结构Fig 1 The composition and simplified structure of IGFBPs and IGFBP-rPs

图2 IGFBP/GFBP-rP 与胰岛素结合机制Fig 2 The mechanism of IGFBP/IGFBP-rP binding to IGF

IGFBP7 的功能及作用机制 IGFBP7 参与细胞黏附和肿瘤细胞增殖等过程。转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）和维甲酸等能上调前列腺上皮细胞中的IGFBP7［25］。同时，IGFBP 降解后的N 端片段仍具有细胞膜黏附的作用［45］。IGFBP7 能够与 Activin 结合，调节腺体组织的生长发育和卵泡刺激素的生成［46］。IGFBP7 能够与Ⅳ型胶原结合，促进脐静脉内皮细胞的黏附和形态改变［47］。IGFBP7 定位于细胞表面，与蛋白聚糖作用，促进细胞黏附于纤连蛋白和黏连蛋白5 等［48］（图3）。IGFBP7 通过调控细胞周期参与细胞增殖。在肿瘤领域，IGFBP7 可以通过抑制细胞周期蛋白D1 和 p21 的表达，并促进细胞周期蛋白 A、E、p16、p27 表 达［48-50］，或 通 过 抑 制 Akt 的 激 酶 活 性 ，引 起CDK 抑制因子 p27Kip1和 p21Cip1上调［51］，诱导细胞停滞于G0/G1 期。细胞内过表达或细胞培养液中添加外源IGFBP7，可以通过非IGF-I 受体、AKT、ERK 途径诱导细胞停滞于G2 期，进而导致细胞凋亡［52］。IGFBP7 还可以通过提高SMARCB1（SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily B，member 1）水平，进而提高BNIP3L（BCL2 interacting protein 3 like）水平，同时抑制 BRAF-MEK-ERK 通路，诱导细胞衰老和凋亡［53］。IGFBP7 还可以通过丝裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路抑制IGF 对细胞的促分化作用，但不影响 IGF 的促增殖作用［54］。

图3 IGFBP7 的作用与调节Fig 3 The functions and regulation of IGFBP7

IGFBP7 在肾脏损伤中的作用 IGFBP7 参与多种肾脏病的发生发展。败血症引起的AKI 中，IGFBP7 通过激活ERK1/2 及通路相关蛋白，如细胞 周 期 蛋 白 D、p21、Bcl-2、Bax（BCL2 associated X），诱导细胞停滞于 G0/G1 期［55］。在糖尿病肾病中，TGF-β1 通过SMAD2（a family of proteins similar to the drosophila mothers against decapentaplegic，member 2）和 SMAD4 上调 IGFBP7 表达，同时上皮标志物E-cadherin 下调，间充质标志物α 平滑肌肌动蛋 白（α smooth muscle actin，α -SMA）上 调 。IGFBP7 的敲除可以抑制TGF-β1 诱导的上皮向间充质细胞转化，缓解肾纤维化［56］，这与 IGFBP7 在肝纤维化中的实验结果一致［57］，这一机制在糖尿病肾病的肾纤维化中也存在［58］。

综上所述，TIMP2 和IGFBP7 都参与细胞的增殖和凋亡过程［59-60］，目前研究集中在肿瘤领域，而缺少肾损伤领域的研究。 今后的研究重点：（1）TIMP2 和 IGFBP7 在 AKI 引起细胞周期停滞中的作用；（2）TIMP2 和 IGFBP7 为何上调，如何反映肾脏损伤，能否作为治疗靶点；（3）基于TIMP2、IGFBP7 细胞周期抑制/促进机制、表达分布差异、随肾损伤程度的变化、蛋白分布的变化等研究，有助于指导对肾损伤不同病因、不同程度、不同部位（如近端小管、远端小管、集合管或间质）的诊断。

结语TIMP2 和IGFBP7 本身功能多样、作用机制复杂，与细胞增殖和凋亡的关系密切。在AKI发生早期，二者在尿液中的含量显著升高，TIMP2可 能 通 过结合 α3β1整 合 素 受 体、促进 p27Kip1和 p21Cip合成、Wnt/β-catenin 通路等机制调控细胞周期；IGFBP7 可能通过与Ⅳ型胶原结合、与蛋白聚糖作用参与细胞黏附，通过调节p21、p27、ERK1/2 等蛋白参与细胞增殖。尿液中二者的增加也可能是由肾小管上皮细胞分泌/重吸收功能的异常所引起。在AKI 中下调TIMP2 对肾脏有潜在的保护作用，上调IGFBP7 则具有潜在促进纤维化的作用。TIMP2 与IGFBP7 作为目前 FDA 认证的临床 AKI早期标志物，研究其在AKI 过程中的生物学功能，对AKI 的早期诊断及治疗具有重要的指导意义。

作者贡献声明张杨 文献调研，图表绘制，论文构思、撰写和修订。王一梅，姜物华 论文校审和修订。赵栓，丁小强 论文指导和修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。