传染性单核细胞增多症和传染性单核细胞综合征患儿PD-1以及Tregs差异比较

吴园园 潘艳艳 蔡红娇 纪军 张利

辽宁省大连市中心医院中心实验室 116033

传染性单核细胞增多症（IM）是儿童时期常见的急性增生性疾病，由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起，临床以发热、头痛、咽峡炎、皮疹、非典型性淋巴细胞增多、淋巴结与肝脾肿大以及出现异性淋巴细胞为特征，除了EBV外，其他病原体也可以引起类似临床症状的综合征，为传染性单核细胞综合征（IMS）。虽然致病原不一，然而IMS与IM的临床症状极为相似。IM一年四季均可发病，早期症状不典型，临床表现多样性，故在早期容易出现误诊或是漏诊而导致严重后果［1］。目前国内外已对EBV所致的IM有较深的认识，EBV为常见的疱疹病毒，感染人体后主要宿主细胞是B淋巴细胞，B淋巴细胞可以表达很多EBV特异性抗原分子，而诱导机体产生相应抗原的特异性免疫应答［2］。EBV感染引起机体强烈的免疫应答反应［3］，而对于IMS知之甚少，与IM患儿程序性死亡受体1（PD-1）以及调节性T细胞（Tregs）的比较还未见报道。本研究通过分析40例IM患儿实验室检验指标，尤其是免疫细胞PD-1的表达情况以及Tregs数量，和IMS患儿进行比较，为IM与IMS的诊断和患儿免疫调节干预提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月至2019年9月大连市中心医院儿科收治的40例IM患儿为IM组，均符合《褚福堂实用儿科学（第8版）》［4］中相关诊断标准。以同期收治的40例IMS患儿为对照，EBV DNA检测为阴性。

1.2 外周血EBV DNA检测 采集两组EDTA-K2抗凝外周血2 ml，取1 ml采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，提取DNA，然后应用EBV核酸扩增荧光检测试剂盒（达安公司）定量检测单个核细胞EBV DNA含量，使用的实时荧光PCR仪器为ABIViia7。

1.3 流式细胞仪检测 采集患者EDTA-K2抗凝外周血2 ml，检测T淋巴细胞亚群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+），CD4+T和CD8+T细胞PD-1的表达水平以及Tregs的百分数。所有抗体均购自美国BECKMAN COULTER。使用了以下这 些 抗 体：FITC-CD4、PE-CD8、PC5-CD3、FITC-CD8、PE-PD-1、PC5-CD4、FITC-CD4、PE-CD127、PC5-CD25。每100μl EDTA抗凝外周血加入20μl单克隆抗体，混匀并于暗处室温孵育20 min。外周血加入1.0 ml溶血素，混匀，暗处室温放置10 min。420×g离心5 min，弃上清，加入1 ml 1×PBS上机检测。流式细胞仪为美国BECKMAN COULTERFC500。

1.4 外周血免疫球蛋白和补体水平检测 采集患者外周血2 ml，凝固后1 710×g离心5 min，分离血清采用散射比浊法检测血清免疫球蛋白G（IgG）、IgM、IgA，补体C3和C4水平。

1.5 外周血淋巴细胞计数和异型淋巴细胞计数 采集患者EDTA-K2抗凝外周血2 ml，使用希森美康XE-2100进行外周血细胞分类检测，用奥林巴斯显微镜进行异型淋巴细胞计数，并计算出异型淋巴细胞百分比。

1.6 统计分析 计量资料呈正态分布时，使用（±s）表示，组间比较采用两样本均数t检验，计量资料不呈正态分布时（如异型淋巴细胞百分数），使用M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料采用χ2检验。数据用SPSS统计学软件进行分析处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料 IMS组男24例，女16例，年龄（5.11±4.07）岁；IM组男22例，女18例，年龄（8.33±5.32）岁；两组患儿临床资料差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 外周血EBV DNA含量检测 检测两组患儿外周血EBV DNA含量，IM组EBV DNA含量为18.45（4.73，103.33）×105copies/ml，IMS组EBV DNA含量为0。

2.3 白细胞数量比较 检测两组患儿外周血白细胞计数、淋巴细胞百分数和绝对值。研究发现IM组白细胞计数、淋巴细胞百分数和绝对值都明显高于IMS组。同时检测异型淋巴细胞百分数，IM组明显高于IMS组。见表1。

表1 两组患儿白细胞计数、淋巴细胞百分数、淋巴细胞绝对值和异型淋巴细胞百分数比较

2.4 抗体和补体的检测 检测外周血IgG、IgM、IgA水平，发现IgG和IgA水平在IM组明显升高，而IgM水平在IM组有所升高但是两组间差异无统计学意义。天然免疫系统分子补体C3和C4在IM组出现明显降低。见表2。

表2 两组患儿外周血抗体和补体水平比较（mg/dl，±s）

表2 两组患儿外周血抗体和补体水平比较（mg/dl，±s）

注：IMS为传染性单核细胞综合征，IM为传染性单核细胞增多症，Ig为免疫球蛋白

组别IMS组IM组t值P值例数40 40补体C3 103.85±13.01 85.52±8.53-3.722 0.001补体C4 28.36±6.81 20.84±1.31-4.392＜0.001 IgG 874.46±222.10 1 314.86±408.14 4.405＜0.001 IgM 116.87±40.51 165.31±85.07 1.363 0.182 IgA 109.24±73.26 206.53±81.31 5.003＜0.001

2.5 T淋巴细胞亚群百分数比较 检测了外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞百分数。发现IM组CD3+CD4+T细胞数量明显低于IMS组（t=-13.752，P＜0.001），而CD3+CD8+T细胞和总CD3+T细胞明显高于IMS组（t=-11.694，P＜0.001；t=-3.290，P=0.002），见图1。

图1 40例传染性单核细胞增多症（IM）与40例传染性单核细胞综合征（IMS）患儿外周血T淋巴细胞亚群百分数比较。A为CD3+CD4+T细胞的百分数与流式图，B为CD3+CD8+T细胞的百分数与流式图，C为CD3+T细胞的百分数与流式图

2.6 Tregs百分数检测 对具有免疫调节功能的Tregs进行检测发现IM组Tregs数量明显低于IMS组（t=9.742，P＜0.001），见图2。

图2 40例传染性单核细胞增多症（IM）与40例传染性单核细胞综合征（IMS）患儿外周血调节性T细胞（Tregs）百分数检测。A为Tregs百分数，B为Tregs代表流式图

2.7 PD-1表达分析 检测两组患儿外周血CD4+和CD8+T细胞PD-1的表达水平，发现IM组CD8+PD-1+细胞和总PD-1+细胞百分数均明显高于IMS组（t=9.288，P＜0.001；t=7.959，P＜0.001），而CD4+PD-1+细胞百分数在两组之间差异无统计学意义（t=0.177，P=0.860），见图3。

图3 40例传染性单核细胞增多症（IM）与40例传染性单核细胞综合征（IMS）患儿外周血程序性死亡受体1（PD-1）表达分析。A为CD4+PD-1+细胞的百分数与细胞代表流式图，B为CD8+PD-1+细胞的百分数与细胞代表流式图，C为PD-1+细胞的百分数与细胞代表流式图

3 讨 论

IM是儿童时期常见的感染性疾病之一，B细胞是EBV感染的靶细胞［5］。IM发病机制尚未完全阐明，免疫功能的改变在IM中B细胞的增殖和清除病毒方面发挥重要作用［6］，但是IM的发病机制十分复杂，导致其免疫失衡的具体机制尚未完全明了。IMS是非EBV感染所致，疾病初期临床症状与IM极为相似。本研究发现IM组外周血CD3+CD8+T细胞百分数、CD3+T细胞百分数、CD8+PD-1+细胞百分数、PD-1+细胞百分数、白细胞计数、淋巴细胞百分数、淋巴细胞绝对值、异型淋巴细胞百分数、抗体水平都较IMS组明显升高，而CD3+CD4+T细胞百分数、Tregs细胞百分数和补体水平较对照组明显降低。

国内外的诸多研究都表明了IM急性期存在CD3+CD4+T细胞明显降低而CD3+CD8+T细胞明显升高［7］，本研究也得到相似的结果。这是由于B淋巴细胞表面具有EBV受体，B淋巴细胞感染后增生活跃，其抗原性发生改变，后者可引起T淋巴细胞防御反应，形成细胞毒性效应细胞直接破坏受染的B细胞［8］。

在感染性疾病中Tregs在调控机体免疫应答中发挥重要的作用，既能有效清除外来病原体又能有效控制免疫应答的强度而不至于引起严重的组织损伤［9］。本研究发现了Tregs在IM组出现明显的下降，这表明IM感染中Tregs的抑制功能有所下降，可能有利于T细胞对病原体特异性抗原的反应，导致细胞克隆扩增，大量的T细胞增殖，这可能是CD8+T细胞出现明显增加的原因，导致IM患儿免疫失衡。

PD-1是一种T细胞抑制性受体，是近年来发现的一组介导免疫调节的重要抑制分子，在免疫应答的适时终止中扮演着极其重要的角色［10］。PD-1不但在慢性感染中发挥作用［11］，在急性感染中也同样发作用［12］。通常在非持续性的病毒感染中，PD-1表达是下调的，以控制感染和加速病毒的清除。在本研究中发现IM组CD8+PD-1+和PD-1+细胞百分数明显高于IMS组，并且和EBV DNA含量有明显的相关性。有文献报道，在急性感染中，高水平的PD-1表达主要是由于T细胞受体的持续活化［13］，反馈导致PD-1的高水平表达［14］。

除了细胞免疫功能的改变，IM组体液免疫功能也出现明显的改变，血清抗体水平明显高于IMS组［15］。自然免疫系统补体C3和C4的含量在IM患儿体内却明显减少，补体系统的存在使宿主能以相对非特异性的方式对微生物入侵立即进行抵抗［16］。补体激活通常对机体有益，但是由于IM患儿体内强烈的免疫应答反应，补体可能被消耗，而C3和C4出现明显的下降。

综上所述，本研究表明IM患儿较IMS患儿Tregs明显降低，而PD-1在CD8+T细胞上的表达却明显增强，这为IM的诊断和患儿免疫调节干预提供理论基础。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。