MTHFRC677T与PAI-14G/5G基因多态性与缺血性脑卒中发生风险的相关性研究

韩欣汝 尹雁惠 王倩 于克炜 张翔

济南市中心医院临床药学科 250013

脑卒中是由多种因素诱发的脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，进而造成急性脑血液循环障碍，临床表现为一次性或永久性脑功能障碍，具有高发病率、病死率、致残率和并发症多等特点，是全球第二大死亡原因［1］。《中国脑卒中防治报告（2019）》发布脑卒中是国人疾病所致寿命损失年的第1位病因。全球疾病负担研究显示，我国总体脑卒中终生发病风险为39.3%，位居全球首位，随着脑卒中危险因素的流行，我国脑卒中疾病负担有暴发式增长的态势，推测2030年我国脑血管病事件发生率将较2010年升高约50%［2］。其中，缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占所有脑卒中事件的80%以上，缺血性脑卒中的发生和进展受遗传和环境因素相互影响，对高血压、糖尿病、高胆固醇血症、吸烟、酗酒等高危因素的适当管理和控制，只能在一定程度上降低其发生率［3］。目前，研究遗传变异与缺血性脑卒中易感性之间的关系，做到提前诊断、积极预防成为近年来关注的重点。目前，有研究显示，亚洲人群缺血性脑卒中发生风险相关基因有5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）4G/5G、F5 41721G＞A，其中F5 41721G＞A亚洲人群突变率低，且此样本中均无突变，在此不过多研究。同型半胱氨酸（Hcy）是一种含硫氨基酸，通过再甲基化和转硫基途径代谢以避免在体内聚集，Hcy水平升高已被证实是缺血性脑卒中的危险因素之一［4］，研究表明，MTHFR基因C677T多态性是导致血浆Hcy升高的主要遗传因素。MTHFR是催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸的关键酶，5-甲基四氢叶酸是Hcy转化为甲硫氨酸所需的甲基供体。MTHFR C677T基因中常见的C突变T可使酶活性降低35%，5-甲基四氢叶酸水平降低10%［5］，最终导致血浆Hcy水平升高。一项meta分析表明，MTHFR TT患者发生血管疾病的风险显著更高，TT与CC纯合子的卒中优势比（OR）为1.26（1.14～1.40）［1］。PAI-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是参与调节纤溶系统活性的平衡的重要组成部分，而纤溶系统活性的平衡是防止血栓形成的重要保护机制［6］。PAI-1的功能包括抑制组织型纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的活性，阻碍纤溶酶原转化为纤溶酶。此外，PAI-1除了调节tPA和uPA活性外，还在代谢和血管疾病、脑损伤的进化和中风后的恢复中发挥着多种作用。目前研究发现，具有4G等位基因的个体在纯合子条件下PAI-1水平升高。但PAI-1 4G/5G基因多态性与缺血性心脑血管疾病在不同地区、人群及种族的研究结果不一致，一直存在争议［7-8］。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集济南市中心医院2016年6月至2020年1月入院并进行基因多态性检测的患者，最终筛选出进行缺血性脑卒中发生风险相关基因检测的468例患者纳入本研究。其中292例患者住院时有缺血性脑卒中病史，定义为卒中组，176例无脑卒中患者定义为对照组。所有研究对象为山东地区汉族人群，患者间无血缘关系，包括各年龄层和性别。缺血性脑卒中的诊断标准为急性局灶性或全局性神经功能缺损，持续时间＞24 h，无明显原因（血管源性原因除外），从症状出现72 h内经脑部计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）扫描连续证实。

1.2 方法

1.2.1 数据收集 记录入组患者信息，吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病史、冠心病史，并测定空腹血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.2.2 基因位点测定 用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采集2～3 ml静脉血，采用荧光染色原位杂交检测法。取150μl临床全血加入1 ml NH4Cl预处理液（北京华夏时代基因科技发展有限公司），静置5 min后，待液体颜色变为澄清红色，室温3 500 r/min离心5 min，离心半径8.5 cm，弃上清液，再加入核酸纯化试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），混匀后加入相应的测序反应通用试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），采用双通道实时荧光定量PCR仪（TL988A，西安天隆科技有限公司）完成MTHFR C677T与PAI-1 4G/5G的基因检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS 25.0对数据进行统计学分析。计量资料（年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C）呈非高斯分布，以M（P25，P75）表示，采用Wilcoxon秩次检验比较卒中组与对照组的临床特征差异。采用卡方检验分析基因型分布和等位基因频率。通过多因素logistic回归分析，在加性模型、隐性模型和显性模型中，校正年龄、性别后，研究MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G多态性与缺血性脑卒中风险之间的关系。以MTHFR C677T为例，定义加性模型，CC、CT和TT分别编码为2、1和0，显性模型中CC编码为1，CT、TT编码为0，隐性模型中TT编码为0，CT、CC编码为1。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线水平 共有468例患者参与此项研究，包括292例缺血性脑卒中患者（男181例，女111例），176例无缺血性脑卒中病史的患者（男87例，女89例），结果显示，与对照组相比，性别（男性）、糖尿病史、吸烟史、饮酒史等变量均有增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表1。

表1 两组进行基因多态性检测患者的基线信息

2.2 MTHFR C677T与PAI-1 4G/5G多态性分布MTHFRC677T和PAI-1 4G/5G等位基因频率在卒中组和对照组中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。MTHFR C677T（CC、CT、TT）在卒中组与对照组参与者的基因分布（P＝0.010）以及等位基因频率（C和T）差异有统计学意义（P＝0.002），卒中组患者的TT基因型（49.32%）与T等位基因（67.98%）的频率显著高于对照组，PAI-14G/5G（4G/4G、4G/5G、5G/5G）的遗传分布在卒中组和对照组间差异有统计学意义（P＝0.044），但等位基因频率差异无统计学意义（P＝0.123）。详见表2。

表2 两组进行基因多态性检测患者MTHFRC677T与PAI-1 4G/5G的基因型分布和等位基因频率

2.3 MTHFR C677T与PAI-1 4G/5G多态性与缺血性脑卒中风险的相关性（1）MTHFR C677T基因型中，卒中组的患者中TT与对照组比较，增加了缺血性脑卒中的发生风险，校正年龄和性别后，TT基因型患者的缺血性脑卒中发 生 风 险 是CC的2.208倍（95%CI：1.149～4.243，P＝0.017）。同时采用显性（CC比TT+CT）和隐性（TT比CT+CC）模型评估MTHFRC677T对缺血性脑卒中风险的影响，其中隐性模型与缺血性脑卒中发生风险呈正相关（OR＝2.375，95%CI：1.149～4.243，P＝0.017），综上数据说明，T等位基因增加了缺血性脑卒中的发生风险。（2）PAI-1 4G/5G基因型中，卒中组的患者中4G/5G基因型与对照组比较，增加了缺血性脑卒中的发生风险，校正年龄和性别后，4G/5G基因型患者的缺血性脑卒中发生风险是5G/5G的1.907倍（95%CI：1.090～3.338，P＝0.024）。同时，校正年龄性别后，隐性模型（4G/5G+4G/4G比5G/5G）在卒中组与对照组间差异有统计学意义（OR＝1.857，95%CI：1.094～3.152，P＝0.022）。与4G/4G相比，5G/5G基因型显著降低了缺血性脑卒中的发生风险（OR＝0.424，95%CI：0.209～0.860，P＝0.017），表明5G等位基因对缺血性脑卒中具有保护作用。详见表3。

表3 468例进行基因多态性检测患者3种遗传模型与缺血性脑卒中发生风险的关联性

2.4 MTHFR C677T与PAI-1 4G/5G的基因多态性联合与缺血性脑卒中发生风险的相关性 数据显示，MTHFR TT与PAI-1 4G/4G或4G/5G基因型联合作用，发生缺血性脑卒中的风险高于对照组，其发生风险分别是MTHFR CC与PAI-1 5G/5G基因型组合的4.946倍（95%CI：1.546～15.819，P＝0.007）和3.193倍（95%CI：1.100～9.268，P＝0.033）。详见表4。

表4 进行基因多态性检测患者MTHFRC677T与PAI-1 4G/5G联合与缺血性脑卒中发生风险的关联性

3 讨 论

缺血性脑卒中的发生和进展与脑血管危险因素密切相关，寻找其相关致病基因，做到提前诊断、积极预防成为近年来研究的重点。本研究收集山东地区患者MTHFR C677T与PAI-1 4G/5G基因多态性数据及缺血性脑卒中高危致病因素，首次阐明了MTHFRC677T与PAI-1 4G/5G基因组合与山东地区人群缺血性脑卒中发生风险相关性，根据对两者基因多态性的统计分析得出，MTHFR C677T中T等位基因和PAI-1 4G/5G的4G等位基因的存在可能增加缺血性脑卒中的发生风险。研究表明，MTHFR TT与PAI-1 4G/4G组缺血性脑卒中的发生风险最高，此外，当联合PAI-1 4G/5G时，缺血性脑卒中的发生风险也较高。结果表明，山东地区人群中，MTHFRC677T的T等位基因与PAI-1 4G/5G的4G等位基因的可能与缺血性脑卒中易感性相关。

研究得出，MTHFRC677T的加性和隐性模型在卒中组与对照组中存在显著性差异，与CC基因型比较，TT基因型显著增加了山东地区人群缺血性脑卒中的发生风险，这与相关文献报道一致［9］。据文献研究表明，MTHFRTT型变异个体需要更高的血清叶酸水平（≥15 ng/L或34 nmol/L），以克服TT变异引起的MTHFR酶缺陷［10］，对于MTHFR TT型患者可给予适当剂量的叶酸，可提高降低tHcy的能力，同时避免过量补充叶酸导致天花板效应和潜在不良反应。本研究对个体叶酸水平和遗传背景下精准叶酸治疗有一定的参考意义。

PAI-1 4G/5G基因4G等位基因能够通过上调PAI-1基因表达从而引起血浆PAI-1水平升高，抑制纤溶酶的产生而促进血栓形成，与缺血性脑卒中发生风险相关。近年来对PAI-1 4G/5G多态性与缺血性脑卒中之间的关系进行了大量研究，但尚未达成一致结论，Tsantes等［11］收集了7 974例不同种族的数据分析得出PAI-1 4G/5G多态性与缺血性脑卒中没有关联。Bentley等［12］对3 336例和4 200例对照组分析显示，与白种人的4G等位基因相比，PAI-1 4G/5G的5G等位基因与缺血性脑卒中风险相关。Cao等［13］分析了中国人群中4G/4G可使缺血性脑卒中发病风险增加63.9%（与4G/5G+5G/5G基因型比较）。此次研究结果表明，4G/4G与4G/5G均可以增加山东地区人群的缺血性脑卒中发生风险。对于不同研究成果可能的原因有遗传或环境特异性，也可能与特定的卒中分型其潜在的生物机制不同有关，特定的突变或多态性可能选择性的增加特定卒中分型的发生风险。

本研究探讨了山东地区MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G基因多态性分布与缺血性脑卒中发病的相关性并得出个体化风险预测结果，为临床提供更为准确、实用的检测数据。但是此次研究仅收集山东地区人群的数据，为单中心、回顾性研究，样本量小，能否适用于其他地区民族仍需进一步研究，此外，PAI-1 4G/5G的5G等位基因作为缺血性脑卒中保护因素的确切作用机制还有待进一步研究。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。