三阴性乳腺癌患者超声造影征象及其与抑癌蛋白P53、细胞角蛋白5/6的关系*

陈霞，邓晶，栗翠英，叶新华

（1.南京医科大学附属江宁医院 超声诊断科，江苏 南京211100；2.南京医科大学第一附属医院 超声医学科，江苏 南京210029）

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一类具有高侵袭性、高复发转移特征的异质性恶性肿瘤，占所有乳腺癌类型的12%～20%[1]。TNBC 对内分泌和靶向治疗药物不敏感，缺乏统一的治疗方案，患者预后差、病死率高[2]。P53 是一种肿瘤抑制蛋白，通过促进细胞凋亡和DNA 修复调节细胞生长，P53突变可导致异常细胞增殖和肿瘤进展[3]。细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6, CK5/6）是TNBC 的特征性肿瘤免疫组织化学标志物之一，可作为判断TNBC 预后的重要预测因子[4]。超声检查是乳腺癌筛查、术前诊断的常用影像学方法，超声造影通过实时观察造影剂在肿块内血流灌注过程，分析病灶病变情况，为肿块性质鉴别提供可靠影像数据支撑[5]。TNBC 超声造影征象与P53、CK5/6 表达的关系尚不清楚，分析其关系有助于提高临床诊断水平。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年7月—2020年6月于南京医科大学附属江宁医院和南京医科大学第一附属医院超声医学科行乳腺超声造影的98 例TNBC 患者作为研究组。纳入标准：①患者接受手术治疗，术后病理组织学诊断为TNBC，参考《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015 版）》[6]诊断标准；②女性患者，年龄≥18 周岁；③超声造影图像清晰，结果完整。排除标准：①Luminal 型、Her-2 型等其他类型乳腺癌；②合并其他部位恶性肿瘤；③男性患者。研究组患者年龄46～63 岁，平均（55.23±7.31）岁；肿块直径2～5 cm，平均（3.23±0.61）cm。另选取同期本院收治的103 例其他分子分型乳腺癌患者作为对照组，均确诊为乳腺癌，免疫组织化学鉴别为Luminal 型、Her-2 阳性乳腺癌。对照组患者年龄42～65 岁，平均（55.61±7.07）岁；肿块直径2～6 cm，平均（3.29±0.75）cm。两组年龄、肿块直径比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 乳腺超声造影

患者均采用超声诊断仪（意大利百胜集团）行乳腺超声造影检查，常规线阵探头LA523 型，频率4～13 MHz，造影线阵探头LA522 型，频率3～9 MHz。患者仰卧双手抱头暴露双乳及腋下，涂耦合剂，以乳头为中心行放射状扫查，确定病灶位置、大小、形态、纵横比、边缘、内部微钙化、后方回声、血流信号。血流信号采用Adler 半定量法[7]分级，0 级：无血流信号；Ⅰ级：1 或2 处点状或细杆状血流；Ⅱ级：长度大于病灶半径的1 条血流或见几条细小血流；Ⅲ级：2 条长度大于病灶半径的血流或≥5 处点状血流。选定病灶最大切面和血流最丰富切面，保持患者体位和探头位置不变，经肘静脉通道团注六氟化硫微泡（声诺维，上海博莱科信谊药业有限责任公司）悬液（59 mg 声诺维+5 ml 生理盐水）1.2 ml，推注生理盐水5 ml 冲管。启动增强图像，观察病灶内造影剂走向和分布，直到增强程度减弱至接近造影前水平，储存动态图像。采用双盲法由超声科2 位主治医师参考文献[8]进行评估，内容包括增强水平（高增强、等/低/无增强）、增强后结节范围扩大情况、有无充盈缺损、有无均匀增强、有无穿支血管等。双方不一致或不能确定的项目由主任医师参与讨论后确定结果。

1.3 免疫组织化学检测P53、CK5/6的表达

取两组患者术中切除的TNBC 乳腺癌组织标本各0.2 g，固定包埋后制成4 μm 切片，经脱蜡，乙醇梯度水化，高压，加入1%标准马血清稀释，4℃冰箱过夜，PBS 冲洗后加入P53、CK5/6 抗体。再经苏木精复染、乙醇梯度脱水干燥、二甲苯透明，中性树胶封固后由病理科2 位主治医师采用双盲法进行审片。根据染色密度评分（无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分）和阳性细胞百分比评分（≤25%计1 分，>25%～50%计2 分，> 50%～75%计3 分，> 75%计4 分），计算免疫组织化学染色评分，免疫组织化学染色评分等于染色密度评分与阳性细胞百分比评分乘积，≥4 分为阳性，<4 分为阴性[9]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 两组患者超声征象比较

两组患者肿块形态、边缘、微钙化、后方回声、血流分级比较，差异有统计学意义（P<0.05），研究组肿块形态规则、后方回声增强、血流Ⅱ级和Ⅲ级比例患者多于对照组，边缘模糊、有微钙化比例患者少于对照组（P<0.05）。两组肿块直径、纵横比比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和图1、2。

表1 两组患者超声征象比较 例（%）

图1 研究组患者二维超声征象

图2 对照组患者二维超声征象

2.2 两组患者超声造影征象比较

两组患者增强程度、增强后结节范围扩大、充盈缺损、均匀增强比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05），研究组高增强、增强后结节范围扩大不明显、有充盈缺损患者多于对照组，有均匀增强患者少于对照组。两组患者有无穿支血管比较，χ2检验差异无统计学意义（P>0.05）。见表2和图3、4。

表2 两组患者超声造影征象指标比较 例（%）

图3 研究组患者超声造影征象图

图4 对照组患者超声造影征象图

2.3 不同超声征象TNBC患者的P53、CK5/6阳性率比较

TNBC患者P53阳性表达74例，阳性率为75.51%，CK5/6 阳性表达60 例，阳性率为61.22%。不同血流分级患者P53 阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），血流分级Ⅱ级、Ⅲ级患者的P53 阳性率高于血流分级0 级、I 级患者。边缘清晰与边缘模糊患者的CK5/6 阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），边缘清晰患者的CK5/6 阳性率高于边缘模糊患者。TNBC 患者其余各指标的P53 阳性率、CK5/6 阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3 和图5、6。

图5 TNBC患者乳腺组织P53的表达

图6 TNBC患者乳腺组织CK5/6的表达

2.4 不同超声造影征象TNBC 患者的P53、CK5/6阳性率比较

不同增强程度患者的P53 阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），高增强患者的P53 阳性率低于等/低/无增强患者，增强后结节范围扩大是否明显患者的CK5/6 阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05），增强后结节范围扩大不明显患者的CK5/6 阳性率高于增强后结节范围扩大明显患者。TNBC患者其余各指标的P53阳性率、CK5/6阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表3 不同超声征象TNBC患者的P53、CK5/6阳性率比较 例（%）

表4 不同超声造影征象TNBC患者的P53、CK5/6阳性率比较 例（%）

3 讨论

乳腺癌是全世界发病率最高的女性恶性肿瘤，不同类型乳腺癌临床和分子生物学特征不同，治疗反应性、预后也不尽相同。与其他分子分型乳腺癌比较，TNBC 患者侵袭性更高，生存时间更短，40%的TNBC 患者于诊断后5年内死亡[10-11]。因此早期识别和诊断TNBC 是改善患者预后的关键。

超声造影是一种纯血池显像技术，造影剂微泡直径小，几乎和血细胞相近，能随血液循环分布到全身微小血管，微泡造影剂可增加靶组织和周围组织的声阻抗差异提高图像分辨率，实时动态显示靶组织的血流灌注特点，在乳腺癌的诊断、疗效评估、腋窝淋巴结转移判定中有较高价值[12]。本研究发现TNBC 超声征象与其他分子分型乳腺癌存在一定差异性，表现为TNBC 多形态规则，边缘清晰，后方回声增强，血流分级较高，同时内部微钙化少见。张慧等[13]、马文娟等[14]同样也发现TNBC 肿块形态更规则，边界毛刺更少。TNBC 后方回声增强原因与内部成分有关，当肿块成纤维细胞含量增加时，对超声波吸收能力增强，导致肿块后方衰减，反之则增强[15-16]。超声造影征象比较，TNBC 超声增强后结节范围扩大不明显，造影剂在结节内分布不均匀，内部存在充盈缺损。其他分子分型乳腺癌超声增强后结节内部分布尚均匀，内部充盈缺损较少，增强后结节范围扩大明显。其原因为高微血管密度可能导致增强后结节内回声不均匀[17]，出现充盈缺损的原因为恶性程度高的肿瘤新生血管多分布于肿瘤边缘，由于肿瘤细胞生长过快，导致新生血管难以满足肿瘤细胞需求，发生局部缺血坏死[18]，造影时出现充盈缺损。张雪松等[19]指出充盈缺损与雌激素受体阴性表达有关，但尚不支持充盈缺损可作为TNBC 的诊断依据。增强后结节范围扩大不明显可能与癌灶内含大量结缔组织和纤维组织，质地硬，影响新生血管生成有关[20]。

为更好地了解超声造影特征的意义，提高诊断效率，有必要关注超声造影征象与乳腺癌分子标志物的关系。P53 被称为抑癌蛋白，具有调控细胞周期、DNA 复制作用，P53 突变或聚集时会失去原有功能，导致肿瘤进展和生长。P53 在TNBC 中表达上调，且与肿瘤分化程度，淋巴结转移状态相关[21]。本研究结果表明，P53 表达与TNBC 肿块结节血流信号分级、高增强有关，分析原因为P53阳性表达可促使肿瘤细胞增殖和新生血管生成[22]，在超声影像学表现为病灶血供丰富，造影时出现高增强。CK5/6 是肿瘤免疫组织化学标志物，在尿路上皮肿瘤[23]、TNBC[24]、肺鳞癌[25]等多种恶性肿瘤中呈阳性表达，CK5/6 阳性表达与TNBC 淋巴结转移和Ki-67 表达有关[24]。本研究中CK5/6 阳性表达率为61.22%，CK5/6 阳性表达与边界清晰，增强后结节范围扩大不明显有关，杨洁等[26]也指出CK5/6阳性表达的TNBC 结节边界多清晰，内部回声多不均匀。CK5/6 阳性表达者增强后结节范围扩大不明显的原因可能为：CK5/6 的阳性表达代表肿瘤增殖力越强，因此病灶密度偏大，进而影响造影剂在血管内充盈。以上结果说明P53、CK5/6 表达与TNBC 超声造影表现具有一定关系，与P53、CK5/6相关的影像征象可为临床诊疗提供依据。

综上所述，TNBC 与其他分子分型乳腺癌患者超声二维和造影征象均存在明显差异，TNBC 外观缺乏恶性征象，但血流分级偏高，造影后呈高增强，增强后结节范围扩大不明显，且可出现充盈缺损。P53 阳性表达者血流信号分级偏高，造影后高增强，而CK5/6 阳性表达者肿块边界清晰，增强后结节范围扩大不明显。与P53、CK5/6 表达相关超声造影征象有望作为鉴别TNBC 的参考指标。