子宫颈鳞状细胞癌中SIAH2蛋白表达的临床意义

甄 娟，刘玉东，吴 莎，宋春红，毕学杰

目前子宫颈鳞状细胞癌的预防和治疗方案已较为完善，然而近年来子宫颈癌发病趋势逐渐年轻化，且仍有50%以上病例发现时已为晚期，患者出现全身衰竭症状，严重影响其生活质量和生存率，因此早期筛查和早期发现危险因素对于改善晚期子宫颈鳞状细胞癌患者的预后至关重要[1-3]。已有大量研究及临床实验从基因、分子等方面入手，以改善患者生活质量及延长患者生存期为治疗目标，寻找更有前途的治疗途径。研究发现，E3泛素连接酶SIAH2在有增殖能力的正常细胞和肿瘤细胞中表达，在不增殖的细胞中表达缺失，SIAH2作为一种重要的肿瘤因子，在恶性肿瘤的发生进展中发挥重要作用[4]。然而，SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义尚未见报道。本实验旨在探讨SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌癌变过程中的表达及其与临床病理特征的关系，并分析SIAH2与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2012年12月～2019年12月间石家庄市第四医院妇科阴道镜活检和手术切除的子宫颈组织标本220例，其中癌旁正常子宫颈组织40例，高级别鳞状上皮内病变60例，子宫颈鳞状细胞癌120例，所有患者术前均未接受放、化疗及其他治疗。标本均经石蜡包埋及HE染色，分别由两名病理医师根据WHO(2014)子宫颈肿瘤分类标准和FIGO(2018)分期系统确定肿瘤的组织学分级以及病理分期。术中同时留取36对子宫颈鳞状细胞癌及癌旁子宫颈组织(经形态学证实为正常子宫颈组织，无病变残留)，组织离体后取少量立即放入液氮后移入-80 ℃冰箱保存，以备RT-qPCR和Western blot检测。所有标本的使用均通过了本院伦理委员会审核，患者均知情同意。

1.2 主要试剂SP试剂盒(KIT9710)、DAB显色试剂、PBS缓冲液均购自福州迈新公司，FastQuant RT Kit试剂盒购自天根生化科技公司，GO Taq qPCR Master Mix试剂盒购自Promega公司，PCR引物合成委托生工生物工程(上海)公司进行。鼠抗人SIAH2抗体(sc81787)购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 采用免疫组化SP法染色。所有组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯、水化，高温高压抗原修复，按SP试剂盒说明书进行染色，SIAH2(抗体浓度1 ∶200)，用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。结果判定：染色结果由两名有经验的中级以上病理科医师阅片审核，SIAH2蛋白在细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片在肿瘤实质区域选取5个高倍视野(400×)，每个视野计数200个瘤细胞。按阳性细胞百分比计分：无阳性细胞计0分，阳性细胞≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，>80%计4分。按细胞着色强度计分：无阳性着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分。将上述两项计分相乘：<3分为阴性，≥3分为阳性[5]。

1.3.2RT-qPCR 采用RT-qPCR法，用Trizol试剂提取36对子宫颈鳞状细胞癌及癌旁正常子宫颈组织总RNA，利用FastQuant RT Kit试剂盒反转录获得cDNA，在ABI 7500上利用GO Taq qPCR Master Mix试剂盒进行RT-qPCR分析。SIAH2上游引物：5′-AGCATCAGGAACCTGGCTAT-3′；下游引物：5′-CTGGTTTCTCCGTATGGTGC-3′。内参18S上游引物：5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′；下游引物：5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。

1.3.3Western blot法 采用Western blot法，收集36对新鲜子宫颈组织，加入裂解液，粉碎匀浆后，低温高速离心(4 ℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清液为总蛋白，Bradford法测定细胞提取物的蛋白浓度。聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳、恒压转印，脱脂奶粉封闭，抗SIAH2(1 ∶150)、抗β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育过夜，与相应二抗室温下孵育2 h，ECL发光。Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值，将目的蛋白与β-actin光密度值比值作为相对表达量。实验至少重复3次，结果取平均值。

1.4 随访所有子宫颈鳞状细胞癌患者术后进行定期随访，随访截至2020年11月31日。采用患者门诊复查及电话随访等方式，每6个月随访1次，开始时间为患者接受手术时间，死亡患者以死亡时间为终止时间，删失者亦纳入分析。

1.5 统计学分析所有数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料率的比较采用χ2检验。SIAH2与HPV16感染、Ki-67蛋白的表达的关系采用Spearman等级相关分析。定量资料采用t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及Log-rank检验比较组间总生存率(overall survival, OS)的差异。Cox比例风险模型筛选子宫颈鳞状细胞癌患者预后的独立预测因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫颈组织中SIAH2的表达SIAH2阳性定位于细胞核(图1)，其在癌旁正常子宫颈组织、高级别鳞状上皮内病变及子宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性率分别为5.00%(2/40)、48.33%(29/60)和75.83%(91/120)，差异有统计学意义(χ2=50.451，P<0.001)。子宫颈鳞状细胞癌中，SIAH2表达与FIGO分期、淋巴结转移和HPV16感染、Ki-67表达密切相关(P均<0.05)，与患者年龄及组织学分级无关(P均>0.05，表1)。Spearman相关性分析显示，SIAH2表达与HPV16感染(r=0.340，P<0.001)和Ki-67表达(r=0.496，P<0.001)呈正相关。

表1 子宫颈鳞状细胞癌中SIAH2表达与临床病理特征的关系

图1 SIAH2在子宫颈组织中的表达，SP法：A.癌旁正常子宫颈组织；B.高级别鳞状上皮内病变组织；C.子宫颈鳞状细胞癌组织

2.2 子宫颈组织中SIAH2的相对表达量RT-qPCR和Western blot法检测结果显示，在36对癌旁子宫颈组织及子宫颈鳞状细胞癌组织中，SIAH2 mRNA的相对表达量分别为29.28±0.68和30.76±0.83，差异有统计学意义(t=-8.220，P<0.001，图2A)；SIAH2蛋白的相对表达量分别为0.21±0.04和0.79±0.07，差异有统计学意义(t=-43.096，P<0.001，图2B)。

2.3 SIAH2表达与子宫颈鳞状细胞癌患者OS的关系生存分析显示，SIAH2阳性和阴性患者的5年平均生存时间分别为42和56个月，5年中位生存时间分别为45和60个月。SIAH2阳性患者的生存时间显著低于阴性患者(Log-rankWardχ2=12.905，P<0.001，表2，图3)。单因素生存分析结果表明，SIAH2表达、FIGO分期及淋巴结转移与子宫颈鳞状细胞癌患者的OS相关(表2，图3)。Cox多因素分析表明，SIAH2高表达是子宫颈鳞状细胞癌患者总生存期的独立预测因子(P<0.05，表3)。

图3 子宫颈鳞状细胞癌临床病理因素与患者OS的关系：A.SIAH2表达；B.FIGO分期；C.淋巴结转移

表2 子宫颈鳞状细胞癌患者OS的单因素分析

表3 子宫颈鳞状细胞癌患者OS的多因素分析

图2 癌旁正常子宫颈和子宫颈鳞状细胞癌组织中SIAH2 mRNA和蛋白的表达：A.RT-qPCR法检测SIAH2 mRNA表达，***P<0.001；B.Western blot法检测SIAH2蛋白表达；C1、C2.子宫颈鳞状细胞癌组织；N1、N2.癌旁正常子宫颈组织

3 讨论

子宫颈癌是全球妇女第四常见的恶性肿瘤[6]。2018年全球子宫颈癌新增约57万例，死亡约31.1万例。子宫颈癌也是我国妇女较常见及预后较差的肿瘤之一。子宫颈癌可分为鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌等，其中鳞状细胞癌占80%。众多高危因素，如持续HPV感染、长期口服避孕药、营养不良、吸烟、早期性行为和多名性伴侣等，均与子宫颈鳞状细胞癌的发生、发展密切相关。手术治疗是早期子宫颈鳞状细胞癌的首选治疗方法，而晚期患者通常同时接受化、放疗，且预后较差[7]。因此，从分子水平寻找控制子宫颈癌的发生、发展及转移的靶向治疗越来越受到临床重视，与子宫颈癌患者预后相关的生物学指标也将逐步被发现，这将有助于临床医师对患者治疗方案的调整，提高患者生存率。

SIAH2基因定位于3Q25号染色体，其编码的蛋白SIAH2是高度保守的E3泛素连接酶，经由RING FINGER区域参与一些底物蛋白的泛素化和水解作用，从而影响细胞的功能，如低氧反应、信号转导通路、细胞生存、线粒体生物合成、细胞增殖、脂肪生成和神经中枢调节等[8-14]。近来研究发现，SIAH2作为癌基因在恶性肿瘤中发挥生物学作用，SIAH2在肺癌[15]、乳腺癌[16]、喉鳞状细胞癌[17]和前列腺癌[18-19]等组织中均高表达。并且，随着肺癌[15]及卵巢上皮性癌[4]恶性程度及临床病理分期的增高，SIAH2表达水平也逐渐增高。在乳腺癌细胞系中过表达SLAH2，能够促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力；而干扰SIAH2表达后，乳腺癌细胞的增殖侵袭能力下降[16]。本组免疫组化结果显示，SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌组织中弥漫阳性，而仅在正常子宫颈组织有增殖活性的细胞中表达，并且其表达模式与Ki-67表达模式相同，说明SIAH2在有增殖能力的正常细胞和肿瘤细胞中表达，这与文献报道一致[4]，从正常子宫颈组织→高级别鳞状上皮内病变→子宫颈鳞状细胞癌组织中，SIAH2的阳性率逐渐升高。RT-qPCR和Western blot结果也显示，从正常子宫颈组织→子宫颈鳞状细胞癌组织中，SIAH2 mRNA和蛋白的表达量显著升高，提示SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌癌变过程中发挥促进作用。众所周知，高危HPV感染与子宫颈癌的发生相关，HPV16常见于鳞状细胞癌，HPV18更常见于腺癌，本组统计分析结果也发现，SIAH2表达与HPV16感染呈密切正相关，可借此推测SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌的发生过程中发挥作用。统计学分析还显示，随着FIGO分期增高SIAH2阳性率显著增加，且与淋巴结转移、Ki-67表达呈密切正相关，推测SIAH2与子宫颈鳞状细胞癌的进展和转移等生物学行为密切相关，并且可能与患者预后有关。

Huang等[20]发现在低氧条件下，白血病细胞株均有较低的PHD3、较高的HIF-1α和VEGF表达。SIAH2的抑制剂维生素K3能够逆转上述变化，并且促进慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼化疗药物的敏感性，从而克服慢性粒细胞白血病的耐药性。这些发现可为临床应用SIAH2抑制剂治疗慢性粒细胞白血病提供依据。由此可见，SIAH2可在肿瘤治疗中发挥一定的作用。本组前期实验在卵巢上皮性癌中发现，SIAH2高表达患者的5年生存率明显降低，无瘤生存期显著缩短，SIAH2是卵巢上皮性癌患者预后的独立影响因素，提示患者预后不良[4]。那么，SIAH2在子宫颈鳞状细胞癌患者预后评估中是否也起到一定作用呢？本实验将常见的临床病理因素纳入单因素分析发现，SIAH2、FIGO分期和淋巴结转移与患者的OS有关，与SIAH2阴性患者相比，SIAH2阳性者的OS下降，生存时间缩短，SIAH2阳性提示患者预后不良；多因素分析发现SIAH2是子宫颈鳞状细胞癌患者总生存期的独立预测因子。

综上，本实验结果表明，SIAH2可能在子宫颈鳞状细胞癌发生、进展和转移过程中发挥重要的促进作用。SIAH2具有成为子宫颈鳞状细胞癌诊断、治疗靶点的可能，可以帮助临床评估患者的预后，然而本实验只是初步验证，其具体机制有待深入探究。