PM2.5对HK-2细胞氧化损伤和凋亡的影响

李柏茹，秦双建，关岚，李闰冰，蔡颖，蒲桔宁，曾明，肖芳，徐新云

(1.深圳市疾病预防控制中心，广东深圳518055；2.中南大学湘雅公共卫生学院，湖南长沙410078；3.南华大学公共卫生学院，湖南衡阳421001)

随着经济迅速发展，环境污染问题日益突出。在大气污染物中占主要成分的大气细颗粒物(fine particulate matter，PM)是指空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物，因其比表面积大故可以吸附大量的有毒有害物质，例如重金属和有机物等。PM可以通过呼吸作用进入深部呼吸道，利用血液运输到达身体的各个部位，甚至可能对心血管系统和肾脏造成损害。2013年“全球疾病负担研究”显示，暴露于环境可吸入颗粒物在全球残疾调整寿命年风险因素中排名第12位。PM可以通过诱导氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等对机体产生损伤。一项关于PM短期暴露的实验研究发现，PM可加重小鼠的氧化应激和炎症反应从而导致小鼠肾脏损伤。另一项研究发现PM可能通过p38MAPK和ERK1/2信号通路来诱导细胞发生氧化应激损伤。短暂的PM暴露与内皮细胞凋亡增加、T淋巴细胞水平升高等有关，并且这些变化可能导致动脉粥样硬化和急性冠状动脉后遗症。研究发现PM暴露不但可诱导活性氧生成还可导致细胞凋亡，进一步研究发现miR-486可以靶向负调控PTEN和FOXO1的蛋白水平以减轻PM诱导的细胞凋亡。还有研究指出PM可以激活血管内皮细胞中COX-2/PGES/PGE2的炎症轴，促进细胞凋亡和炎症反应。尽管当前已经进行了很多关于PM和细胞氧化损伤及凋亡的研究，但是鲜有关于PM导致人类正常肾细胞氧化损伤及凋亡的研究报道，因此本文以人肾上皮HK-2细胞为研究对象，探讨PM处理后对肾细胞氧化损伤和凋亡的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒(APl05)购于联科生物公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、微量还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；HK-2细胞购于中国上海细胞库，0.25% Trpsin-EDTA、DMEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司。

1.2 PM2.5样品采集与制备

用武汉天虹TH150F中流量采样器和80 mm直径的石英滤膜，按100 L/min的流量连续采样3 d，每天24 h不间断，采样地点在太原山西大学校园和深圳市疾病预防控制中心楼顶。对吸附有PM的滤膜称质量后剪成2 cm×2 cm小块放于烧杯中，加入超纯水完全浸没滤膜，用一层锡箔纸使烧杯口密封，超声振荡30 min后取出滤膜，将PM样品悬浊液转移到干净的真空冷冻物料盘中，再次用锡箔纸密封后于-80℃冰箱冷冻24 h；用封口膜替换锡箔纸，并在膜上点密集的小孔，于真空冷冻干燥机中干燥24 h至PM完全干燥；然后在无菌工作台中用超纯水溶解干燥的PM颗粒，混合均匀，将PM混悬液分装标记后于-20℃保存待用，每次使用前振荡混匀。

1.3 HK-2细胞培养与PM2.5处理分组

使用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养HK-2细胞，待细胞状态稳定且汇合度达80%时使用DMEM稀释的PM培养液进行处理，根据前期CCK-8试验得到深圳市和太原市PM处理HK-2细胞的IC分别为136和95.98 μg/mL，Cr处理HK-2细胞的IC为16.75 μmol/L，因此本文设置PM浓度为50 μg/mL，阳性对照组Cr浓度为10 μmol/L，在培养箱中处理24 h后收集细胞，进行各指标检测。

1.4 检测细胞氧化损伤

PM处理细胞24 h后，吸出培养液，用冷PBS洗3次，加入免疫沉淀(immunol precipitation，IP)细胞裂解 液(碧 云 天，P0013)400 μL对25 cm培 养 瓶(Corning，430639)中细胞裂解30 min，用细胞刮将细胞从培养瓶刮下，细胞混合物移入1.5 mL EP管中并在冰上超声破碎5 s，间断3 s，重复5次，于14 000 r/min在4℃离心20 min，取上清液于-80℃冰箱保存；用二辛可宁酸法(BCA法)进行样品蛋白定量；严格按照试剂盒说明书进行MDA含量、SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性的检测和计算。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集PM处理24 h的细胞于1.5 mL EP管中，加入l mL预冷的PBS，离心3 min后弃去上清(重复两次)；将试剂盒中的5×结合缓冲液用去离子水稀释为工作液(1×)，取适量预冷的工作液加入到EP管中并吹打重悬细胞，调整细胞浓度为1×10~1×10个/mL。每组取100 μL细胞悬液到1.5 mL EP管中，分别加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，轻微混匀后室温避光孵育15 min；无需洗涤，每管再加380 μL预冷的工作液并充分吹打混匀；上流式细胞仪检测分析。

1.6 统计分析

实验数据以xˉ±s表示，所有实验重复3次；应用SPSS 24.0软件进行统计分析，采用方差分析进行组间比较，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞氧化损伤检测结果

PM处理HK-2细胞24 h后，结果显示：与阴性对照组相比，深圳PM样品组、太原PM样品组和阳性对照组中MDA的浓度依次升高，分别升高8.16%、34.51%和72.23%(图1A)；SOD活性依次降低，分别降低7.49%、19.67%和29.55%(图1B)；GSH的浓度依次降低，分别降低10.43%、16.39%和37.43%(图1C)。太原PM样品组与阴性对照组的差异均有统计学意义(

P

<0.05或

P

<0.01)；GSH-PX的活性分别降低42.70%、61.62%和60.98%，3组与阴性对照组间的差异均有统计学意义(

P

<0.01，图1D)。

图1 PM2.5处理HK-2细胞后MDA、SOD、GSH和GSH-PX的变化

2.2 细胞凋亡情况的变化

如图2所示，HK-2细胞经过24 h处理后，流式细胞术结果显示，与阴性对照组相比，深圳PM样品组、太原PM样品组和阳性对照组的细胞凋亡率分别升高197.25%、301.22%和399.08%，差异均有统计学意义(

P

<0.05或

P

<0.01)。

图2 PM2.5处理HK-2细胞对细胞凋亡率的影响

3 讨论

根据全球疾病负担研究，2015年环境PM的暴露导致了全球420万人死亡。在中国，100多万人的死亡可归因于PM的暴露。Huang等在一项国家横断面研究中发现长期暴露于浓度范围较广的PM与慢性肾脏疾病患病率增加存在相关性。也有学者研究发现室外空气污染与肾癌的发生有着密切联系。以往关于PM对肾脏毒性的研究大多为对大鼠进行急性或亚急性染毒，很少有低浓度PM对肾细胞进行处理探讨氧化损伤和凋亡的研究，因此本研究针对HK-2细胞PM处理前后氧化损伤和凋亡情况进行了测定。

在正常生理情况下，机体内的氧化和抗氧化防御系统处于动态平衡，当外界有害因素作用于机体时，平衡遭到破坏，ROS产生过多、脂质过氧化，并最终对机体细胞、组织造成损伤，激活促肿瘤原性信号传导，增强细胞存活和增殖并造成DNA损伤。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，其中的MDA含量可以反映机体内脂质过氧化的程度，即受自由基攻击的严重程度，MDA含量越高可以间接反映出细胞损伤程度越大。SOD能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，SOD的活性越低代表细胞的抗氧化能力越差。GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持脱氧核糖核酸的生物合成、细胞的正常生长发育及细胞免疫等多种重要生理功能，GSH含量是衡量机体抗氧化能力的重要因素，GSH含量越低同样代表机体抗氧化能力越差。GSH-PX可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，如果GSH-PX含量降低，将无法正常消除氧自由基及保护机体免受氧化损伤。此前鲜有关于PM处理HK-2细胞发生氧化损伤以及诱导细胞凋亡的相关研究报道，而Cr已经被证实可以诱导细胞产生氧化损伤和凋亡，因此本研究中选择Cr处理的HK-2细胞作为阳性对照组来帮助我们了解PM是否可以诱导HK-2细胞产生氧化损伤和细胞凋亡。查阅文献后我们选取了4个可以反映细胞氧化损伤情况的经典指标即MDA、SOD、GSH和GSH-PX，各处理组与对照组相应指标进行比较，若指标变化情况同阳性对照组变化情况类似，我们则认为PM可以导致细胞发生氧化损伤。本研究发现：与阴性对照组相比，深圳、太原市PM样品组和阳性对照组MDA含量依次升高，SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性依次降低，该结果种变化情况与PM致其他细胞系氧化损伤的结果相同。本研究结果显示Cr具有导致HK-2细胞发生氧化损伤的作用，深圳市和太原市PM均可引起HK-2氧化损伤指标发生与Cr处理后相类似的变化，说明两市PM都可以导致HK-2细胞发生氧化损伤，且太原市PM的作用强于深圳市PM。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的自主有序的细胞死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，是细胞适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，在胚胎发育阶段细胞凋亡可以清除多余的和已完成使命的细胞，保证胚胎正常发育；在成年阶段细胞凋亡可以清除衰老和病变的细胞，保证机体健康。迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚，但当射线、药物或者发生肿瘤、自身免疫性疾病时凋亡过程会发生紊乱。本研究发现，两市PM样品组细胞相较于阴性对照组凋亡率均增加，说明深圳和太原市PM可以诱导正常肾细胞发生凋亡。氧化应激不仅与疾病的发生发展有关，并且与细胞凋亡有密切关系。PM可以通过引起肾小管上皮细胞氧化应激反应加重进而产生细胞损伤并且导致细胞发生凋亡。本研究发现，在致氧化损伤和致凋亡两个方面，太原市PM作用均强于深圳市PM。细颗粒物含有多种危害人体健康的物质，其中包括部分具有致突变和致癌作用的重金属和多环芳烃类(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)有机污染物。本实验室前期对PM成分进行了检测分析，利用气相色谱-质谱法测定深圳市(南方城市)和太原市(北方城市)在2018—2019年间PM中16种多环芳烃的含量，发现太原PM多种PAHs浓度均高于深圳，特别是苯并(b)荧蒽、苯并(a)芘等显著高于深圳(P<0.01)。PAHs进入人体会经过代谢产生可与DNA共价结合形成DNA加合物的代谢物，之后在人体进行生物转化形成大量活性氧，造成DNA氧化性损伤进而诱导癌症的发生。本实验室前期测定2017—2018年深圳和太原市PM中的金属元素，发现深圳市和太原市PM中排名靠前的金属元素有Al、Pb、Mn、Cr、Cu、V、Ce、As、Ni等，其中太原市PM中的Pb、Al、As、Ni和Mn含量均高于深圳市PM(P<0.05)。As、Ni、Cr与多种癌症有关，并且具有明显致癌致突变作用，这提示持续暴露于空气中低浓度的PM可对人体健康产生危害。

综上所述，本研究发现PM处理后可引起肾HK-2细胞发生氧化损伤以及凋亡，PM可能通过致细胞氧化损伤和凋亡的方式发挥细胞毒性。本研究结果为今后深入探讨PM对肾脏的损伤提供了基础数据。