p62蛋白在食管鳞癌细胞中核浆易位的机制研究

杨荔艳，刘奏，郝佳洁，张钰，，王明荣，

(1.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院检验科，北京100021；2.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021)

食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我国高发且预后较差的恶性消化道肿瘤，其发病率位居我国恶性肿瘤的第3位，死亡率位居第4位，严重威胁我国人民的健康甚至生命。食管鳞癌患者死亡率高的原因，一方面在于食管鳞癌患者早期阶段常无任何症状，且相当比例的患者在确诊时已无法切除或已出现影像学可见的转移灶，而发生转移的晚期食管鳞癌患者未经药物治疗的中位生存时间小于6个月，使用一线化疗药物治疗后的中位生存时间也仅为8~13.8个月。因此，研究发现食管鳞癌中特异的分子标志，建立有效的诊断方案，将有助于提高早期食管鳞癌患者的检出率，从而降低其死亡率。

我们前期研究发现p62在食管鳞癌细胞的细胞浆中表达，而在正常食管细胞中定位于细胞核，即存在明显的核浆易位，尤其是在约30%的T1N0M0期的食管鳞癌组织中可以观察到p62在癌细胞浆中表达，表明p62的核浆易位在食管鳞癌发生发展过程中是一个早期事件，有可能作为食管鳞癌早期诊断的分子标志。进一步的功能研究表明，细胞浆表达的p62显著增强食管鳞癌细胞的抗凋亡能力。

p62(sequestosome-1，SQSTM1)是一种多功能的泛素化结合接头蛋白，包括PB1、ZZ、TB、LIR、KIR及UBA多个结构域，以及两个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和一个核输出信号(nuclear export signal，NES)。多项研究表明，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞的自噬水平下降，目前已在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌和结肠癌等多种肿瘤中发现了p62的高表达。特别地，胞浆中p62的积累是预测前列腺癌患者不良预后的独立因素，这与我们在食管鳞癌中的发现一致。

p62在食管鳞癌中发生核浆易位的分子机制目前尚无文献报道，我们推测p62在食管鳞癌细胞中出现核浆易位也可能与核定位信号或者核输出信号相关位点的磷酸化状态相关。本研究基于前期研究结果和文献报道，首先通过构建p62不同磷酸化突变体，并将其转至KYSE30细胞和内源性敲降p62的KYSE150细胞中，研究p62磷酸化状态与其核浆定位的关系；进一步通过Co-IP、PLA实验，初步探索可能影响p62磷酸化的激酶。本研究结果将为深入了解p62在食管鳞癌细胞中核浆易位的分子机制提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

p62抗体购于MBL，GSK-3β抗体购于CST，GFP和GAPDH抗体均购于Proteintech。引物由北京天一辉远公司合成，定点突变试剂盒KOD Plus Mutagenesis Kit购于TOYOBO公司。转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，Protein A/G磁珠购于MCE公司，邻位连接实验试剂盒购于Sigma公司。

主要仪器包括激光共聚焦显微镜(PerkinElmer)，电泳仪(BIO-RAD)，电转仪(Tanon天能)，微板分光光度计(BioTek Instruments)。

1.2 细胞系及培养条件

食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE150和KYSE510由日本京都大学Shimada教授惠赠，用于包装慢病毒的人胚肾细胞株HEK293FT由本实验室保存，以上细胞均经过短串联重复序列(short tandem repeat，STR)验证。食管鳞癌细胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养。HEK293FT细胞使用含10%胎牛血清、1%L型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1%遗传霉素G418的DMEM培养基进行培养。

1.3 免疫荧光实验

选取前期报道的p62内源性高表达的食管癌细胞(KYSE150，KYSE510及KYSE70)，将细胞接种至玻片上，同时设置实验组和对照组，细胞贴壁后，实验组加入1 μmol/L核输出抑制剂KPT330，对照组加入等体积的溶剂处理30 min。然后弃去原培养基并使用PBS清洗，经过4%多聚甲醛固定和5%BSA封闭后，使用p62一抗进行孵育，再用FITC标记的二抗进行免疫荧光染色，DAPI复染标记细胞核，利用激光共聚焦显微镜进行观察。

1.4 磷酸化质谱鉴定

培养并收集足量的KYSE510细胞，加入SDT裂解液，超声裂解细胞(超声条件：80 W，工作10 s，间歇15 s，循环10次)；沸水浴15 min，14 000 r/min离心40 min，取上清，BCA法进行蛋白质定量，分装样品，-80℃保存，送中科新生命科技公司进行LC-MS/MS鉴定；取400 μg蛋白进行酶解，然后使用Anti-Anti-P-Tyr antibody beads富集磷酸化肽段；获得的酶解产物使用Maxquant软件(版本号1.3.0.5)对质谱数据进行查库，分析质谱获得的肽段所对应的蛋白以及磷酸化位点。

1.5 定点突变体构建

按照常规载体构建方法首先构建pEGFP-C1-p62蛋白全长真核表达载体，然后以此载体为基础按照KOD Plus Mutagenesis Kit(TOYOBO)定点突变试剂盒说明书分别将p62蛋白的T269/S272/S328/S332位点突变成谷氨酸(Glu，E)使其处于持续磷酸化状态，或突变为丙氨酸(Ala，A)使其保持去磷酸化状态，构建出p62不同磷酸化状态的真核表达载体。构建突变体的引物序列(5′-3′)如下：T269A上游GCACCCGTCTCTC CAGAGAGTTCCAGCA；T269E上游GAACCCGTCTCT CCAGAGAGTTCCAGCA；T269下 游CAGGCGGCTTC TTTTCCCTCCGTGC。S272A上 游GCACCAGAGAGTT CCAGCACAGAGGAGA；S272E上游GAACCAGAGAG TTCCAGCACAGAGGAGA；S272下 游GACGGGGGTC AGGCGGCTTCTTTTC。S328A上 游GCAGATAACTGT TCAGGAGGAGATGATG；S328E上 游GAAGATAACT GTTCAGGAGGAGATGATG；S328下游CTCCATCTGT TCCTCAGGGCGCCCC。S332A上 游GCAGGAGGAGAT GATGACTGGACCCATC；S332E上游5GAAGGAGGAGA TGATGACTGGACCCATC；S332下 游ACAGTTATCCG ACTCCATCTGTTCC。

1.6 慢病毒包装及感染

按照常规载体构建方法首先将针对p62 UTR1序列的shRNA寡核苷酸构建至PLKO.1载体上，鉴定获得PLKO.1-shp62质粒。shRNA寡核苷酸由天一辉远公司合成，序列(5′-3′)如下：上游CCGGTGCCTAATGG CTTTCACTTTCCTCGAGGAAAGTGAAAGCCATTAGGC ATTTTT；下 游-AATTAAAAATGCCTAATGGCTTTCA CTTTCCTCGAGAAAGTGAAAGCCATTAGGCA。

将HEK293FT细胞接种于6 cm培养皿，置于37℃培养箱中培养16~18 h，使细胞汇合度达到70%；利用转染试剂lipofectamine 2000将慢病毒的包装质粒psPAX2、pMD2.G以及PLKO.1-shp62质粒按照3 μg：3 μg：6 μg的比例共同转染至KEK293FT细胞中；转染完成后，每隔24 h收集一次病毒上清，共收集两次，然后使用0.22 μm滤膜将病毒上清过滤，分装后置于-80℃保存备用。

将生长状态良好的食管鳞癌细胞接种至6孔板中，细胞贴壁后汇合度约50%；然后弃去原培养基，更换为1 mL新鲜的完全培养基，加入0.5 mL病毒上清和8 μg/mL的polybrene进行感染；感染12 h后，弃去含病毒的培养基，更换为含嘌呤霉素的新鲜培养基，进行抗性筛选，获得稳定敲降p62的食管鳞癌细胞。

1.7 免疫共沉淀实验

收取足量的食管鳞癌细胞，使用非变性裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；取1 mg总蛋白平均分为两份，一份加入p62抗体(购自于MBL)，另一份加入等量的与p62同一种属来源的正常同型IgG(购自于CST)，4℃孵育过夜；然后加入50 μL proteinA/G磁珠(购自于MCE)，4℃孵育1 h，经磁性分离后获得复合物；将沉淀用20 μL 3X SDS上样缓冲液重悬，置于95~100℃金属浴中加热2~5 min，12 000 r/min离心1 min获得蛋白上清以进行后续的Western blot实验。

1.8 邻位连接实验

按照试剂盒说明书进行操作。细胞接种同免疫荧光实验，然后细胞爬片依次经固定、封闭、一抗孵育、探针孵育、连接、扩增后固定于载玻片上，使用激光共聚焦显微镜进行观察。

2 结果

2.1 p62是一个具有核浆穿梭功能的蛋白

免疫荧光实验结果(图1)显示，食管鳞癌细胞经核输出抑制剂KPT330处理30 min后，绿色荧光信号(p62)即转移至细胞核，而对照组绿色荧光信号一直分布在细胞浆。说明食管鳞癌细胞在被核输出抑制剂处理前后，p62蛋白存在由细胞浆到细胞核的易位。

图1 利用核输出抑制剂处理后，p62聚集在细胞核

2.2 p62蛋白的磷酸化状态与其核浆定位相关

我们选取前期报道的p62内源性高表达的KYSE510细胞进行了磷酸化质谱分析，发现在KYSE510细胞系中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332共4个位点的磷酸化(图2)，其中T269/S272位于核定位信号(NLS2：261~272)内，S328/S332位于出核信号(NES：302~320)附近。

图2 食管鳞癌细胞中存在T269/S272/S328/S332共4个位点的磷酸化

我们将不同位点磷酸化的质粒瞬时转染至p62内源性低表达的KYSE30细胞中，培养48 h后，通过免疫荧光实验结合激光共聚焦显微镜观察，发现AAAA处理组(4个位点全部非磷酸化)信号定位在细胞浆，AAEE(269/272位点非磷酸化，328/332位点磷酸化)处理组定位在细胞浆，EEAA(269/272位点磷酸化，328/332位点非磷酸化)处理组定位在细胞核，EEEE处理组(4个位点全部磷酸化)定位在细胞浆(图3A)。同时，为了排除内源性p62的影响，我们通过慢病毒包装系统，筛选获得稳定表达p62不同磷酸化状态的细胞株。免疫荧光实验结合激光共聚焦显微镜观察，发现在内源性p62稳定敲降的细胞中p62的核浆定位情况与KYSE30细胞的结果一致(图3B)。

图3 T269/S272/S328/S332的磷酸化状态影响p62蛋白的核浆定位

2.3 GSK-3β可能是影响p62磷酸化的激酶

我们分析发现，p62的S328/S332位点的序列S328-D-N-C-S332，与GSK-3β磷酸化底物基序S/TX-X-X-Sp匹配。因此，我们利用Co-IP实验检测了p62与GSK-3β的相互作用情况，结果显示p62和GSK-3β存在同一复合物中(图4A)。我们进一步通过邻位连接技术分析了KYSE150细胞中p62与GSK-3β的相互作用方式，激光共聚焦显微镜观察发现，使用p62与GSK-3β抗体共同孵育细胞后出现红色的阳性信号，即产生了邻近效应。以上结果说明，p62与GSK-3β存在直接的相互作用。

图4 p62与GSK-3β存在直接的相互作用

3 讨论

p62目前已被证实是一种致癌蛋白，其高表达在肿瘤细胞周期调控、增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程中发挥重要作用，具有肿瘤诊断、预后判断、治疗监测等价值。我们前期研究发现p62在食管鳞癌细胞中存在明显的核浆易位现象，本研究基于前期基础，探讨了p62在食管鳞癌细胞中发生核浆易位的可能的调控方式。有研究发现p62蛋白在宫颈鳞癌HeLa细胞中可以穿梭于细胞浆和细胞核之间，且这种现象受到核定位信号或其附近位点磷酸化的调控。我们推测p62在食管鳞癌细胞中出现核浆易位也可能与核定位信号或者核输出信号相关位点的磷酸化状态相关。我们通过磷酸化质谱分析发现在食管鳞癌细胞中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332等4个位点的磷酸化，其中T269/S272位于核定位信号(NLS2：261~272)内，S328/S332位于出核信号(NES：302~320)附近。通过构建这4个位点的磷酸化突变体，发现其磷酸化状态与其出核和入核过程相关。特别地，T269/S272位点磷酸化、且同时S328/S332位点去磷酸化后，p62定位至细胞核中。说明在食管鳞癌细胞中，p62的磷酸化状态确与其核浆定位相关，但是其磷酸化又受到何种分子的调控？从图3结果看，S328/S332位点磷酸化对于p62的胞浆定位至关重要。关于S328/S332位点的磷酸化，迄今尚无研究报道，且无商售抗体。我们分析了p62蛋白发生磷酸化的序列，发现包含S328/S332位点的序列S328-D-N-C-S332，与GSK-3β的磷酸化底物基序S/T-X-X-X-Sp相互匹配。GSK-3β是一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于GSK-3激酶中的一种亚型，可以磷酸化多种底物，影响增殖、代谢、DNA修复等多个生物学过程。在作用机制上，GSK-3β可以通过介导AMPK通路抑制自噬而促进乳腺癌细胞的迁移能力；通过激活Akt/GSK-3β/Nrf2通路，提高细胞的抗氧化应激能力；通过抑制细胞自噬，增强非小细胞肺癌的放疗敏感性，因而是一个潜在的治疗靶点。因此，我们首先利用Co-IP实验证实p62与GSK-3β存在相互作用，进一步利用PLA实验明确p62是否为直接的底物与GSK-3β相互结合。PLA技术是一种特殊的免疫分析方法，可将蛋白信号放大1 000倍，检测两个蛋白最大距离为30 nm，是验证两个分子直接相互作用的最有效手段，可作为两个蛋白质之间相互作用的定性依据。本研究结果显示，p62与GSK-3β蛋白存在邻近效应，即二者为直接的相互作用，据此我们推测GSK-3β有可能是调控p62蛋白S328/S332位点磷酸化的潜在激酶。

综上所述，本研究在食管鳞癌细胞中发现p62蛋白S328/S332位点磷酸化状态影响其核浆定位，且可能是由激酶GSK-3β调控的，这些发现对于深入认识p62在食管鳞癌中的作用具有重要意义。