基于初烤烟叶表面微观结构特征的叶片区段划分

高 辉，杨晶津，李思源，王玉真，刘 静，汪显国，刘继辉，杨盼盼，邱昌桂*，高占勇*

1.云南同创检测技术股份有限公司，昆明市高新技术产业开发区海源北路1699 号 650106

2.红云红河烟草（集团）有限责任公司，昆明市五华区红锦路367 号 650231

微观结构是指物质、生物、细胞在显微镜下的结构。其中，植物叶片表皮提供的微观结构特征，可用于植物系统发育和品质形成的相关研究［1-4］。《烤烟》标准利用叶片表皮细胞排列的疏密程度来评价叶片结构，利用细胞密度、烟叶厚度或单位面积质量对其身份进行定义［5］。朱尊权［6］、于华堂等［7］研究表明，叶片表皮细胞呈疏开状态的烟叶成熟度较好。过伟民等［8-10］、高辉等［11］的研究认为，烟叶表面微观结构指标与其部分外观品质、色度和物理特性存在显著相关性，在评价烟叶成熟度和叶片结构等方面具有重要作用。可见，以细胞形态特征为代表的烟叶表面微观结构与外观品质指标密切相关。此外，有关烟叶微观形态特征的研究还包括不同土壤环境［12-13］、水分条件［14］、品种［15-17］和部位［10］烟叶微观结构的差异性分析，以及基于烟叶表面微观结构特征的变化来确定采收成熟度等［18-19］。由于烟叶叶片不同区段的生理特性和在生长过程中接受的光照条件等生态因子不同，致使同一叶片不同区段的内含物质代谢状况不同［20-21］，最终导致烟叶叶片不同区段的化学成分含量［22-25］和物理耐加工性能［26］等存在较大差异。在烟叶原料分段打叶复烤中较科学、合理的烟叶分切方法研究方面，祁林等［24］以石油醚提取物作为评价指标，采用传统的聚类方法对烟叶不同区段进行了划分；龙明海等［27］以近红外光谱信息的主成分综合得分作为评价指标结合Fisher 最优分割法对烟叶区段进行了划分；高辉等［28］基于初烤烟叶不同区段的色差参数变化，利用Fisher 最优分割法对烟叶区段进行了划分。但基于烟叶表面微观结构特征差异对叶片区段进行划分的研究尚鲜见报道。为此，以扫描电镜图像的PHOTOSHOP 软件量化处理为手段，分析云烟87 B2F、C3F 初烤烟叶不同区段表面微观结构特征指标的变化，并基于不同区段表面微观结构特征的差异利用Fisher 最优分割法对烟叶进行划分，最后通过感官评吸验证分切后各区段叶片之间感官品质的差异性，旨在为烟叶合理分切和差异化打叶复烤提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、设备和仪器

以2019 年云南昆明产云烟87 B2F 和C3F 初烤烟叶作为试验材料，分别选取约5 kg 颜色均匀一致，无青杂色、病斑和破损的烟叶以供电镜观测和感官评吸。

G2 Pro 台式扫描电子显微镜（荷兰PHENOM公司）；QS-1 试样切丝机（郑州中烟科技开发有限公司）；AB204-S 型电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；KBF 540 恒温恒湿箱（德国Binder 公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验样品制作

从2 个部位的烟叶样品中各选取10 片置于（20±1）℃、相对湿度为65%±2%的恒温恒湿箱中平衡48 h。先切除无叶片的叶柄部分，再利用刻度尺测量每片烟叶的长度，并根据叶长将其平均分成10 个区段（图1），然后沿主脉测量并记录每个区段中心点到叶基端的距离，最后再利用裁纸刀将其分切成10 段，B2F 和C3F 烟叶从叶基到叶尖的10 个区段依次标记为B1～B10、C1～C10。

图1 叶片分切方法示意图Fig.1 Schematic diagram of 10 segmented leaf areas

1.2.2 烟叶表面扫描电镜图像采集

按照文献［11］的方法和要求采集2 个部位烟叶不同区段叶片正面的扫描电镜图像。

1.2.3 烟叶表面扫描电镜图像处理

参照文献［8］的方法利用PHOTOSHOP 16.0对扫描电镜图像中的细胞面积和周长进行量化处理，并计算细胞形态因子。

细胞形态因子是反映细胞形状与圆形相差的程度及不规则程度，其数值越大，表示形状偏离圆形越远，形状越不规则［29］。

按照文献［30］中的方法计算气孔密度和气孔指数。

1.2.4 分切烟叶感官品质评价

2 个部位的烟叶经Fisher 最优分割法分析后，再各自选取若干片，根据最优分割比例对烟叶进行分切、去梗和切丝。按照文献［31］中的方法制作感官评吸样品，并采用三点检验法［32］评价分切叶片间的感官品质。

1.2.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2010 对烟叶表面微观结构特征指标随区段位置的变化进行回归分析。利用R 语言中的scale 函数对原始数据进行标准化处理。利用Fisher 最优分割法对烟叶区段进行划分。

2 结果与讨论

2.1 烟叶不同区段表面微观结构特征指标的变化

云烟87 B2F 和C3F 烟叶10 个区段表面微观结构特征指标的变化趋势如图2 所示，其中C3F烟叶不同区段表面细胞形态的部分扫描电镜图片见图3。由图2 可以看出，从叶基到叶尖，细胞面积、细胞周长和细胞形态因子呈先增大后减小的抛物线形变化趋势，细胞密度和气孔密度呈先降低后升高的抛物线形变化趋势，气孔指数总体呈线性增加的趋势。回归方程的拟合度均较高（R2≥0.878 0），且回归方程经方差分析检验均达到极显著水平（P<0.01）。叶基部和叶尖部的细胞面积、周长相对较小，形状相对较规则，细胞密度和气孔密度较高；叶中部的细胞面积、周长较大，形状较不规则，细胞密度和气孔密度相对较低。烟叶不同区段表面微观结构特征存在差异的主要原因可能是由于不同区段的生理特性以及在生长过程中所受的光照条件等生态因子不同，致使其内含物质积累量不同［20-21］，最终导致烟叶不同区段的品质、物理特性和表面微观结构特征也存在差异。

图2 云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同区段表面微观结构指标的变化Fig.2 Variation trends of surface microstructure indexes for different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

图3 云烟87 C3F 烟叶10 个区段叶片表面的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy pictures of 10 segments of C3F tobacco leaves of Yunyan 87

成熟度好的烟叶细胞形状不规则程度较高，叶片结构相对疏松的烟叶细胞密度较大，身份相对适中的烟叶气孔密度较小［6-8］。本试验结果表明，叶片中部的成熟度较好，身份适中，叶片结构的疏松度相对较差；叶基部和叶尖部的成熟度相对较差，身份偏薄，而叶片结构的疏松度较好。

此外，从云烟87 的B2F 和C3F 初烤烟叶相同区段表面微观结构指标均值可以看出，细胞面积、细胞周长、气孔密度、气孔指数总体存在B2F >C3F的趋势，细胞形态因子、细胞密度总体存在C3F >B2F 的趋势。由于不同部位烟叶自身生理特性、生长状况及光照条件的差异，导致部位间叶片的物理特性存在较大差异。中部叶的成熟度及疏松度高于上部叶，且身份适中，油润感较强，因此在表面微观结构上，中部叶的细胞面积、细胞周长小于上部叶，而细胞密度、细胞形态因子则大于上部叶，部位间叶片表面微观结构的变化趋势与过伟民等［10］的研究结果一致。

2.2 基于表面微观结构特征和Fisher 最优分割法的烟叶区段划分

2.2.1 表面微观结构指标数据标准化处理

云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同区段表面微观结构指标的标准化结果见表1。

2.2.2 烟叶区段直径计算

Fisher 最优分割法用“直径”来表示段内的差异程度，段内差异越小，“直径”就越小，一般采用离差平方和作为“直径”［33］。根据表1 中的标准化指标矩阵分别得到云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同区段的“直径”，结果见表2。

表1 云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同区段表面微观结构指标的标准化值Tab.1 Standardized values of surface microstructure indexes of different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

表2 云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同区段“直径”计算结果Tab.2 Diameters of different segments of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

2.2.3 烟叶不同分类数最小目标函数计算和分类

根据不同区段“直径”的计算结果（表2），按照文献［34］中的方法得到云烟87 B2F 和C3F 烟叶10 个区段不同分类数k的最小目标函数值e［p（n，k）］和具体分类情况，结果见表3。

表3 云烟87 B2F 和C3F 烟叶不同分类数的最小目标函数值及分类Tab.3 Minimum objective function and classification of different k values of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

2.2.4 烟叶最优分类数确定

根据表3 绘制出云烟87 B2F 和C3F 烟叶最小目标函数值e［p（n，k）］与分类数k值的关系图（图4）。由图4 可见，最小目标函数值e［p（n，k）］随k值单调递减。

图4 云烟87 B2F 和C3F 烟叶最小目标函数e［p（n，k）］与k 值的关系Fig.4 Relationship between the minimum objective function e［p（n，k）］and k value of B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

B2F 烟叶在k值为3 和4 处出现明显拐点，所以分3 类或4 类较好。根据文献［33］通过计算最小目标函数比值β（k）=e［p（n，k-1）］/e［p（n，k）］可知，β（3）=2.970，β（4）=2.461，β（3）>β（4）。因此，k=3时为最优分类数，即B1～B2、B3～B7、B8～B10。此外，按照文献［34］中的方法计算并比较Fα与F的大小，云烟87 B2F 烟叶分3 段时的F值为24.977，则F>F0.05（F0.05=4.737）。因此，云烟87 B2F 烟叶的最优分割比例（叶基∶叶中∶叶尖）为20%∶50%∶30%。

C3F 烟叶在k值为3 时出现明显拐点，因此分3 类较好，即C1～C3、C4～C8、C9～C10。经计算云烟87 C3F 烟叶分3 段时的F值为22.717，则F>F0.05。因此，云烟87 C3F 烟叶的最优分割比例（叶基∶叶中∶叶尖）为30%∶50%∶20%。

2.3 分割烟叶感官品质的检验

根据上述分析结果，按照分割比例要求对云烟87 B2F 和C3F 烟叶进行分切，不同分切样品间的感官品质差异性检验结果见表4。可以看出，对于云烟87 B2F 和C3F 初烤烟叶，分切后各区段烟叶间的感官品质特征均存在显著差异，说明叶片表面微观结构特征结合Fisher 最优分割法能将一片烟叶中品质差异较大的区段有效分开。

表4 云烟87 B2F 和C3F 分割烟叶的感官品质差异性检验Tab.4 Difference examination of sensory quality of segmented B2F and C3F tobacco leaves of Yunyan 87

3 结论

①烟叶不同区段的表面微观结构特征总体存在一定差异，从叶基到叶尖，细胞面积、细胞周长和细胞形态因子量化值呈先增大后减小的抛物线形变化趋势，细胞密度和气孔密度呈先降低后升高的抛物线形变化趋势，气孔指数总体呈线性增加趋势。②基于标准化的微观结构指标数据，利用Fisher 最优分割法确定了云烟87 的B2F、C3F 烟叶的最佳分割比例（叶基∶叶中∶叶尖），B2F 为20%∶50%∶30%，C3F为30%∶50%∶20%。③2个部位烟叶分切后各区段间的整体感官品质特征均存在显著差异，叶片表面微观结构特征结合Fisher 最优分割法能将同一片烟叶品质差异较大的区段有效分开。