miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中的表达

孙 龙，郝迎学

(中国人民解放军陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院，重庆 400038)

急性Stanford A型主动脉夹层是一种危险性极高的心脏大血管疾病，及时诊治是挽救患者生命的关键[1].有研究[2]显示：D-二聚体、脑型肌酸激酶等实验室指标在急性Stanford A型主动脉夹层快速诊断中具有一定的价值，但特异性和敏感度仍欠佳.探讨急性Stanford A型主动脉夹层的发病机制对提升该类患者的临床诊治水平具有重要意义[3].近年来的研究[4]显示：miRNA分子能够调控血管炎症反应，在脑卒中、冠心病等心脑血管疾病的发病机制中发挥重要作用.相关研究[5]显示：miR-22靶向作用于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)，诱发异常的免疫炎症反应，加速心肌细胞衰老和心脏成纤维细胞失活，参与冠心病的发生与发展，但在主动脉夹层病变中作用的相关研究报道仍十分少见.本研究主要探讨miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中的表达特点及可能的作用机制.

1 对象与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月—2019年10月中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院急诊入院的急性Stanford A型主动脉夹层患者26例为研究组，其中，男20例，女6例；年龄33～74岁，平均(56.28±8.59)岁.

入选标准：入院时急诊CT检查确诊为急性Stanford A型主动脉夹层；患者家属自愿参与本研究.

排除标准：存在认知功能障碍；临床资料不完整或标本采集不达标.

另收集同期收治的瓣膜性心脏病患者26例为对照组，其中，男22例，女4例；年龄36～71岁，平均(55.60±9.15)岁.

入选标准：接受主动脉瓣膜置换术治疗，患者家属自愿参与本研究.

排除标准：合并胸膜主动脉夹层、大动脉炎、马凡综合征等主动脉病变的患者.

两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性.本研究经医院伦理委员会批准(批号：LGI2018-013).

1.2 主要试剂与仪器

Trizol试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒(广州国奥生物技术有限公司)；兔抗人NLRP3单克隆抗体、鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1单克隆抗体、鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP(北京博蕾德科技有限公司)；PTC-200 PCR扩增仪(Bio-Rad公司，美国)；DU800紫外分光光度计(Beckman公司，美国)；化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国).

1.3 方 法

1.3.1 标本采集与处理

采集两组患者空腹外周静脉血5 mL，EDTA抗凝处理，室温下放置30 min，2 000 r/min离心30 min，将上层血清分装到离心管中，编号后置于-80 ℃保存.术中采集边长约0.5 cm的主动脉壁组织标本，10%甲醛溶液固定后存放于EP管中，编号后置于-80 ℃保存.

1.3.2 RT-PCR检测

取血清和主动脉壁组织标本，使用Trizol试剂盒抽提总RNA，测定浓度和纯度，反转录得到cDNA.miR-22、NLRP3、Caspase-1、Caspase-3及内参GAPDH引物设计由广州伯信生物科技公司完成.miR-22引物序列：上游5′-TGGGTACCTTAAG TCAAGAGTG-3′；下游5′-AGGTGCTGTGGTC AACT CAGTT-3′.NLRP3引物序列：上游5′-GGTCGACC TCACACATGGGTCC-3′；下游5′-GGATGTGTTACG GACACCA-3′.Caspase-1引物序列：上游5′-CTGAC TGATGGAGTACTTCT-3′；下游5′-CCTCGACGTTCC TCCAACAT-3′.Caspase-3引物序列：上游5′-CTCA TGTAGTGGTCGTCGTAG-3′；下游5′-CCGTCATTA GGCGGTC GGAA-3′.GAPDH引物序列：上游5′-A GTCTCGTTACGTAGGACGTGGTG-3′；下游5′-GCG GTATGA GTCGTGGTCGTAG-3′.反应体系20 μL，反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，共30个循环，延伸72 ℃ 2 min.行2%琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH为内参，计算相对表达量.

1.3.3 Western blot检测

RIPA裂解动脉壁组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度.取蛋白样品50 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜至PVDF，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，滴加兔抗人NLRP3单克隆抗体(1∶500稀释)、鼠抗人Caspase-1单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人Caspase-3单克隆抗体(1∶200稀释)，4 ℃过夜，滴加羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000稀释)，室温静置1 h，ECL显色，暗室中显影，使用化学发光凝胶成像系统读取各目标条带的灰度值.

1.3.4 血清炎症因子水平检测

取血清标本，使用Elisa试剂盒检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、IL-18、核因子κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶16(MMP-16)浓度，操作按说明书进行.应用紫外分光光度计读取吸光度值，用说明书提供的标准曲线方程计算浓度.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 两组患者临床资料

研究组患者突发性撕裂样胸痛、心功能分级Ⅲ～Ⅳ级、冠状动脉受累、重度主动脉瓣关闭不全的患者比例明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表1.

表1 两组患者临床资料Tab.1 Clinical data of patients in the two groups

2.2 两组患者外周血血清及主动脉组织中miR-22表达水平

研究组患者外周血血清中miR-22表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；研究组患者主动脉壁组织中miR-22表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表2.

表2 两组患者外周血血清及主动脉组织中miR-22表达水平

2.3 两组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平

研究组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；研究组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的蛋白表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见图1，表3.

1～3对照组；4～6研究组.图1 主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3 蛋白表达的Western blot电泳Fig.1 Western blot electrophoresis of NLRP3，Caspase-1 and Caspase-3 protein expression in aortic tissue

2.4 两组患者外周血血清炎症因子水平

研究组患者外周血IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表4.

表3 两组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of NLRP3，Caspase-1，Caspase-3 mRNA and protein in aortic tissue of two groups

3 讨 论

急性Stanford A型主动脉夹层具有很高的致死率，早期及时诊断和治疗是改善患者预后的关键.D-二聚体、脑型肌酸激酶、肌球蛋白等临床常用的主动脉夹层诊断指标具有一定的价值，但缺乏敏感度和特异性[6].探讨急性Stanford A型主动脉夹层的发病机制对疾病的早期诊断与治疗具有重要意义.近年来的研究[7-8]显示：miR-22靶向调控NLRP3基因参与大鼠主动脉夹层的发生与发展，其中，炎症因子异常表达和细胞凋亡发挥重要作用.在此基础上，本研究采用RT-PCR和Western blot检测miR-22及其可能的靶向调控基因在急性Stanford A型主动脉夹层患者中的表达情况，并探讨相关作用.本研究结果显示：研究组患者外周血血清及主动脉组织中miR-22表达水平明显高于对照组，提示miR-22在急性Stanford A型主动脉夹层患者中存在高表达，与上述基础研究中的结论一致.进一步的研究发现：研究组患者主动脉组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组，可推测miR-22高表达能够靶向作用于NLRP3，并升高NLRP3的表达水平，另外，NLRP3炎症小体激活能够诱发Caspase-1、Caspase-3活化，进而上调Caspase-1、Caspase-3表达水平.

多项研究[9-10]结果显示：NF-κB是一种可与免疫球蛋白基因κB序列特异性结合的蛋白，NF-κB过度激活参与自身免疫性炎症和动脉粥样硬化的发生与发展，主动脉夹层可能与NF-κB介导的免疫炎症反应有关.MMPs是锌离子依赖性蛋白水解酶家族，能够调节机体的炎症反应和降解细胞外基质，与多个炎症信号通路和细胞凋亡有关，与夹层动脉瘤的发生密切相关[11-13].研究[14-15]发现：MMP-16能够通过在胞外特异性活化MMP-2，引发MMP-2与TIMP-2之间的平衡失调，动脉细胞外基质降解，胶原弹性纤维含量下降，促进主动脉中层的退行性病变，是主动脉夹层发生与发展的病理基础之一.白细胞介素是多种细胞分泌的炎性因子，在信号传递、激活和调节免疫细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞活化增殖中均发挥重要作用[16-17].相关研究[18-21]显示：活化的NLRP3小体能够促进Caspase-1活化，进而诱发IL-1β、IL-10、IL-18的成熟与分泌；主动脉夹层形成时，血管内皮细胞能够激活Caspase-1、巨噬细胞分泌炎症因子.本研究结果显示：研究组患者外周血IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16水平均明显高于对照组，提示急性Stanford A型主动脉夹层患者存在炎症因子高表达，可能与病情的发生与发展有关.

综上所述，急性Stanford A型主动脉夹层是一种多因素共同参与的疾病，miR-22是易感基因，能够通过上调NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的表达，激活免疫炎症反应，诱发IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16的大量分泌，最终导致主动脉夹层强度降低和结构弱化，增加了急性Stanford A型主动脉夹层的发生风险.