螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞免疫功能的影响

季 露，朱 萌，张 文，于美玲，韦英益，覃志彪，胡庭俊

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

在水产养殖中，为保证养殖动物的存活率、实现更高的经济价值，养殖户普遍采用增强养殖动物免疫力的手段。免疫增强剂能够有效提高养殖动物的免疫力，增强养殖动物的淋巴细胞活性，强化其杀菌能力。一般免疫增强剂的药剂包括多糖类、维生素类、益生菌等[1]。据报道，使用含有褐藻多糖的饲料饲喂斑节对虾，虾的生长性能提高，血细胞总数、酚氧化酶活性、呼吸爆发、SOD活性、吞噬活性、细菌清除和杀菌活性增强，表明饲喂添加褐藻多糖的日粮能够增强虾免疫系统抵抗副溶血性弧菌感染的能力[2]。在克氏原螯虾的饲料中添加黄芪多糖能够不同程度地提高克氏原螯虾肝胰腺和肌肉中的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性，表明黄芪多糖能够提高克氏原螯虾的免疫功能[3]。螺旋藻多糖是从螺旋藻（Spirulina）中分离提取出来的水溶性天然产物，是螺旋藻的主要生物活性成分之一。螺旋藻多糖可以参与调节细胞活性，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射和降血糖等作用[4]。本试验通过CCK8法检测，筛选获得螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞安全浓度，选择适宜浓度处理对虾血淋巴细胞12 h，观察螺旋藻多糖提取物对血淋巴细胞中ACP、AKP和POD活性的影响，以评估螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

螺旋藻多糖提取物，由广西大学动物科学技术学院药理实验室提取。黄芪多糖，淡黄色粉末，购自北京生泰尔生物科技集团，总糖含量为70%。

1.1.2 试验细胞

南美白对虾血淋巴细胞采自广西水产科学研究院南美白对虾良种基地提供的SPF级南美白对虾。

1.1.3 试验试剂

Leibovitz's L-15培养基（美国，HyClone）；胎牛血清（美国，Gibco）；L-谷氨酰胺、青-链霉素、PBS（北京索莱宝科技有限公司）；CCK8（南京诺唯赞生物科技有限公司）；POD（南京建成生物工程研究所，批号：20200102）；ACP（南京建成生物工程研究所，批号：20200103）；AKP（南京建成生物工程研究所，批号：20191226）；BCA（南京建成生物工程研究所，批号：20200102）；柠檬酸三钠（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.4 试剂的配制

0.01 mol/L PBS溶液：22.40 g的PBS磷酸盐干粉溶于双蒸水，定容至2 L，调节pH值7.0～7.2。高压灭菌（121℃、15 min），封口，保存，备用。

L-15完全培养基（100 mL）：L-15培养液88 mL、胎牛血清10 mL、10×青链霉素混合液1 mL、谷氨酰胺1 mL，无菌混合，备用。

5%柠檬酸三钠抗凝剂：5.00 g柠檬酸三钠溶于100 mL双蒸水中，高温、高压灭菌，备用。

1.1.5 试验仪器

C150二氧化碳培养箱（德国，BINDER）、Cellometer Auto 2000细胞计数仪（美国，Nexcelom）、TS100倒置显微镜（日本，Nikon）、Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪（瑞士，TECAN）、Direct-Q 5UV纯水系统（德国，Merck Millipore）、JY92-ⅡD细胞超声破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞收集

在超净工作台中先使用75%酒精喷洒南美白对虾体表，使用酒精棉球擦拭以除菌。采用加入抗凝剂的2 mL注射器从南美白对虾头胸甲后缘与第一腹节的连接处取血淋巴液，在4℃、1 000 g离心10 min，弃去上清，收集细胞，加入L-15完全培养液，使用培养液将血淋巴细胞悬浮起来，保证细胞全部散开。取20μL细胞悬液用于细胞计数，以确定需要加入培养液的量使细胞培养板每个孔中的细胞密度分布均匀。将细胞悬液加入细胞培养板上，培养板置于28℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.2.2 CCK8法测定细胞存活率

将上述原代细胞配制成2×106个细胞/mL的细胞悬液。取0.2 mL分别接种到96孔板中，放置于28℃、5%CO2恒温培养箱中孵育过夜。将细胞分为细胞对照组（不含药物的血淋巴细胞）、试验组（含药物的血淋巴细胞）、空白组（不含细胞及药物），每组设置6个复孔。细胞贴壁后，弃去上清。在空白组和对照组的孔里各加入0.2 mL培养液，在试验组孔中分别加入含不同浓度螺旋藻多糖提取物（50、100、200、400、800、1 600 mg/L）培养液0.2 mL/孔。在培养箱中继续培养24 h，每孔加入CCK8液20μL，培养箱中孵育4 h，在酶标仪上测定各孔的吸光度（OD）值，波长450 nm，每组取6个复孔平均值。用以下公式计算细胞活力。

1.2.3 免疫相关酶活性的测定

设置对照组（不含药物的血淋巴细胞）、试验组（含螺旋藻多糖提取物的血淋巴细胞）、阳性药物对照组（含黄芪多糖的血淋巴细胞），每组设置3个复孔。将原代细胞配制成3×107个细胞/mL的细胞悬液，取2 mL分别接种到24孔板中，放置在28℃、5%CO2培养箱中培养孵育过夜。细胞贴壁后，弃去上清。在对照组各孔中加入2 mL完全培养基，在阳性对照组孔中各加入含200 mg/L黄芪多糖的完全培养基，在试验组孔中分别加入含不同浓度（50、100、200、400 mg/L）螺旋藻多糖提取物的完全培养基，2 mL/孔。在培养箱中继续培养12 h，弃去上清，PBS洗细胞2次，每孔再加入1 mL PBS，使用刮刀将细胞刮下来，收集细胞，超声破碎，测定酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和过氧化物酶（POD）等的活性，严格按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）操作。

1.3 数据统计与分析

数据利用SPSS 21.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）分析，使用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞存活率的影响（见表1）

由表1可知，与细胞对照组相比，当螺旋藻多糖提取物浓度范围在50～400 mg/L时，对南美白对虾血淋巴细胞的存活率无显著影响（P＞0.05）；当药物浓度为800～1 600 mg/L时，细胞存活率极显著降低（P＜0.01）。因此，选用螺旋藻多糖提取物50、100、200、400 mg/L作为下一步试验的浓度。

表1 不同浓度的螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞存活率的影响Tab.1 Effect of different concentrations of Spirulina polysaccharide extract on activity of blood lymphocytes of Penaeusvannamei

2.2 螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞中免疫相关酶活性的影响（见表2）

由表2可知，与对照组相比，黄芪多糖组和50、100、200 mg/L试验组的ACP活性均极显著升高（P＜0.01）；50 mg/L试验组的AKP、POD活性均极显著升高（P＜0.01）；100 mg/L试验组的AKP、POD活性显著升高（P＜0.05）；200 mg/L试验组的POD活性极显著升高（P＜0.01）；400 mg/L试验组的AKP、POD活性分别显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）升高。

表2 螺旋藻多糖提取物对南美白对虾血淋巴细胞中免疫相关酶活性的影响Tab.2 Effect of Spirulina polysaccharide extract on the activity of immune-related enzymes in blood lymphocytes of Penaeusvannamei

3 讨论

甲壳类动物由于缺乏脊椎动物的适应性免疫，因此主要依靠先天免疫系统，免疫系统主要由三部分组成：物理防御、细胞免疫和体液免疫[5-6]。甲壳类动物体液免疫主要依靠血淋巴中的酶、免疫因子以及调节因子等[7]。在细胞免疫中，血细胞发挥着巨大作用。血细胞受到损伤时，甲壳类动物的免疫功能将会下降[8-9]。AKP和ACP是反映虾非特异性免疫功能的重要指标[10]，是甲壳动物溶酶体的重要组成成分，与血细胞的吞噬作用和包囊作用相联系[11]，可以直接参与磷酸基团的转移和代谢反应，在甲壳类动物血液和血细胞中起着重要的机体防御作用。刘晓云等[12]研究发现，ACP和AKP以酶原形式存在于小颗粒细胞的颗粒中，过氧化物酶原被合成并储存在颗粒细胞和小颗粒细胞的颗粒中。在正常健康的虾机体中，这些颗粒不会在细胞中表现出酶活性。但是，当虾患病时，颗粒细胞能以细胞解体的方式排出细胞内的颗粒，转化成有活性的酶，所以导致血清中ACP和AKP活性升高。POD是机体内重要的酶类之一，参与多种生理代谢反应，能够减少自由基对正常细胞的损伤，清除细胞生理代谢过程中的活性氧，从而提高机体的解毒免疫功能和抗病能力[13]。

多糖能够提高体外细胞的免疫活性。Li等[14]研究发现，从辣木叶中提取的1种新型多糖（MOP-3），能够增强巨噬细胞的能力、促进巨噬细胞分泌活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），表明该多糖能够激活巨噬细胞产生细胞因子，从而达到对抗病原体的目的。魏文青等[15]在探究海藻硫酸多糖对正常小鼠和免疫低下小鼠免疫功能的研究中发现，海藻硫酸多糖体外对T、B淋巴细胞有促增殖作用；对环磷酰胺所导致的免疫功能低下小鼠，海藻硫酸多糖可以通过调节血象，增加胸腺指数，提高T淋巴细胞数量，促进T、B淋巴细胞增殖来提高小鼠免疫功能。谢鹏[16]研究发现，脂多糖可直接作用于对虾血细胞，引起总血细胞数量和三类血细胞数量的变化；脂多糖可以增强血细胞的吞噬能力，引起血细胞的胞吐，释放酚氧化酶原系统。

在本试验中，与对照组相比，50、100、200 mg/L螺旋藻多糖提取物组的ACP活性均极显著升高；50、100、400 mg/L螺旋藻多糖提取物组的AKP活性分别极显著或显著升高；所有螺旋藻多糖提取物组的POD活性均极显著或显著升高，表明螺旋藻多糖提取物可以促进血细胞中酶原颗粒的排出和激活。本试验结果表明，螺旋藻多糖提取物在一定的浓度范围内，可以通过促进血细胞中免疫相关酶的释放和活化来增强机体的非特异性免疫。本研究结果为开发螺旋藻多糖提取物作为南美白对虾生态健康养殖的免疫增强剂提供参考。

4 结论

螺旋藻多糖提取物浓度范围在50～400 mg/L时，对南美白对虾血淋巴细胞的存活率无显著影响，能够提高南美白对虾血淋巴细胞的免疫功能。