儋州市鸡高致病性禽流感免疫效果评估

荣光 叶丹 彭维祺 孙卫平 李学征

摘要为了解儋州市鸡高致病禽流感 H5和 H7亚型二联灭活疫苗的免疫效果，于2020年12月在全市16个乡镇养鸡场（户）采集302份血清，采用血凝和血凝抑制试验（ HA-HI）对禽流感 H5、H7亚型免疫抗体进行检测。结果显示，302份鸡血清样品中，鸡禽流感 H5以及 H7阳性个体数分别为247、215份，合格率分别为82%、71%，均符合农业农村部要求免疫抗体水平达到70%的标准。说明 H5和 H7亚型禽流感二联灭活疫苗的免疫效果较好，有较强的保护力。

关键词高致病性禽流感;免疫效果;评估

中图分类号 S858.31 文献标识码 A  DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.013

Evaluation of Immunity of Chickens to Highly Pathogenic Avian Influenza in Danzhou City

RONG  Guang1） YE  Dan1） PENG  Weiqi1） SUN  Weiping1） LI Xuezheng1 ，2）

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China;

2 Danzhou Center for Animal Disease Control and Prevention， Danzhou， Hainan 571700， China）

Abstract  In  order  to  understand  the  immune  effect  of chicken  inoculated  with  a  bivalent  inactivated vaccine for avian influenza H5 and H7 subtypes in Danzhou City， 302 serum  samples of chicken were collected  from  chicken  farms （households） in 16 townships  of Danzhou  City  in  December， 2020. The hemagglutination  and  hemagglutination  inhibition  tests （HA-HI） were  used  to  detect  the  immune antibodies  of avian  influenza  H5 and  H7 subtypes. The  results  showed  that  there  were 247 and 215 individuals  found  positive  to  avian  influenza  H5 and  H7 subtypes，  respectively  in 302 chicken  serum samples， with the compliance rates being 82% and 71%， respectively， which met the requirements of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs for the level of immune antibodies being upto 70%. The results showed that  avian  influenza  H5 and  H7 subtypes bivalent  inactivated vaccine has  good  immune  effect and strong protection.

Keywords  highly pathogenic avian influenza ; immune effect ; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI），又稱为禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian Influ‐enza Virus， AIV）引发多种禽类感染的疾病综合征[1]，被世界动物卫生组织（ OIE）列为 A类传染病，在我国被列为一类传染病[2-5]。根据对禽类致病性不同，可分为高、低和非致病性3种类型[6]。其中，高致病性禽流感 （ Highly Pathogenic Avian Influenza， HPAI） H5亚型和 H7亚型，传染性最强，发病率和死亡率最高，造成的疫情，对家禽和人类危害最严重[7]。因此，接种疫苗以及对家禽进行禽流感的检测是预防和控制禽流感发生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5和 H7免疫防治过程中，由于场地、母源抗体干扰及操作方法不当等，往往造成免疫保护不够[9-11]。本研究对儋州市16个乡镇的鸡场采集血清，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）试验方法对禽流感 H5、H7亚型免疫抗体进行检测，并对抗体水平进行分析。客观评价儋州市鸡 H5、H7免疫效果，以期对儋州市鸡禽流感抗体水平有一个正确的认识，对海南省无规定动物疫病示范区和自由贸易港建设均具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

阿氏（Alsevers）液 （自配）;1%鸡红细胞悬液（ 自配）; pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亚型（ Re-11株）血凝血抑实验抗原（国生生物，试剂批号：20191106）;禽流感病毒 H7亚型（ Re-2株）血凝血抑实验抗原（国生生物，试剂批号：20191014）。

1.1.2仪器设备

微量移液器;枪头;96孔 V型微量反应板;微型振荡器;高速离心机;恒温箱。

1.2方法

1.2.1样品采集

1.2.1.1取血

于2020年12月在儋州市16个镇的养鸡场（户）采集血样302份。采用鸡翼内静脉采血法，把家禽侧卧保定，展开鸡翅，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球对采血部位进行消毒，然后将采血器针尖斜口向上，以 30°倾斜插入翅静脉，缓缓抽取血液，达到所需血量后，用酒精棉球按压以止血[12-13]。

1.2.1.2血清制备

取适量血样以2000 r/min 离心5～8 min，取上清液于1.5 mL 灭菌离心管中， -20℃保存备用[14]。

1.2.2血凝实验（HA）

（1）分别吸取0.025 mL PBS液加到酶标板微孔的1～12孔中，换滴头。

（2）吸取病毒悬液0.025 mL 加入至第1孔混匀，再从第1孔吸取0.025 mL 加入至第2孔混匀，如此反复，依次稀释至第11孔，再从第11孔吸取0.025 mL，弃之，换滴头。

（3）每孔各加入 PBS 0.025 mL，体积分数为1%鸡红细胞悬液0.025 mL，振荡混匀，室温（20～25℃）静置40 min观察结果。

结果判定∶倾斜反应板，红细胞无呈泪滴状流淌（完全血凝）的抗原的最高稀释倍数表示一个血凝单位（ HAU）。本实验的一个血凝单位为256。

1.2.3血凝抑制实验（HI ）

（1）根据血凝（ HA）试验结果配制4HAU 的病毒抗原。

（2）在微量反应板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加人0.05 mL PBS。

（3）吸取0.025 mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025 mL 于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.25 mL弃去。

（4）1～11孔分别加入含4HAU 的病毒抗原液0.025 mL，室温（20℃）静置至少30 min。

（5）每孔加入0.025 mL 体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，静置约40 min （室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现纽扣状的物质沉于孔底。

结果判定：以完全抑制4个 HAU抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。HI 价小于或等于3log2判定 HI 试验为阴性; HI 价≥4log2为阳性;或按照高致病性禽流感诊断技术（GB/T 18936—2003）进行阳性率的判定。

2结果与分析

2.1 H5血凝血抑检测结果

抗体检测结果见表1。从表1可以得出，2020年秋季儋州市16个镇的鸡禽流感 H5免疫合格率分别为80%、60%、 100%、85%、 100%、 100%、75%、100%、 65%、 85%、 90%、 80%、 100%、 80%、 60%、55%，有12个镇的抗体合格率均达到国家农业农村部的标准（群体抗体水平≥70%）。其中，鸡禽流感 H5亚型抗体合格率达到100%的镇有 C、E、F、H 和 M镇，达到90%≤抗体合格率<100%区间的乡镇只有 K 镇，这些地区的抗体水平高，免疫效果顯著，表明这些地区鸡禽流感 H5亚型的防疫工作受到充分重视，工作落实到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗体合格率<90%区间的乡镇有 A、D、J、L 和 N镇，表明这些镇的抗体水平较高，免疫效果较好，鸡禽流感 H5亚型防疫工作落实较好。在70%≤抗体合格率<80%区间的乡镇只有 G镇，表明 G镇的抗体水平良好，免疫效果一般，防疫工作要进一步加强，努力做得更好。除此之外，B镇、I镇、 O 镇和 P 镇的抗体水平不达标（群体抗体水平<70%），表明这些地区的防疫工作做得不到位，鸡禽流感 H5亚型的防疫工作还应进一步扎实。

2.2 H7血凝血抑检测结果

从表2可以得出，2020年秋季儋州市16个镇的鸡禽流感 H7免疫合格率分别为90%、75%、100%、0、 100%、 100%、 0、 100%、 65%、 100%、 100%、25%、100%、90%、87%、30%， 11个镇的抗体合格率均达到国家农业农村部的标准（群体抗体水平≥70%）。其中，鸡禽流感 H7亚型抗体合格率达到100%的镇有 C、E、F、H、J、K 和 M镇，达到90%≤抗体合格率<100%区间的乡镇有 A镇和 N镇，这些地区的抗体水平高，免疫效果显著，表明大多数地区鸡禽流感 H7亚型的防疫工作受到充分重视，工作落实到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗体合格率<90%区间的乡镇只有 O镇，表明 O镇抗体水平较高，免疫效果较好，鸡禽流感 H7亚型防疫工作落实较好。在70%≤抗体合格率<80%区间的乡镇只有 B镇，表明 B镇的抗体水平良好，免疫效果一般，防疫工作要进一步加强，努力做得更好。除此之外，D、G、I、L 和 P 镇的抗体水平不达标（群体抗体水平<70%），表明这些地区的防疫工作做得不到位，鸡禽流感 H7亚型的防疫工作还应进一步扎实。

结合表1与表2的结果分析可得，秋季检测302份鸡血清中，鸡禽流感 H5、H7亚型免疫抗体阳性数分别是247、215份，合格率分别是82%、71%， H5、H7亚型免疫抗体合格率均达到国家标准。

3讨论与结论

3.1讨论

从检测结果上看，儋州市鸡禽流感 H5和 H7亚型整体免疫效果良好，免疫抗体合格率均达到了国家标准，表明2020年秋季儋州市鸡总体上已建立起了较好的免疫机能屏障，禽流感流行风险较低，但也存在少数乡镇禽流感抗体水平较低的现象。造成这种现象的原因可能与鸡群产生抗体时间、疫苗的质量、免疫操作的规范程度、鸡群的饲养环境等因素有关[15-16]。

从不同类型鸡禽流感免疫抗体水平上看，H5亚型抗体合格率整体略高于 H7亚型，这可能与养殖人员对防疫工作的重视程度、冬春季节的防疫工作落实情况有关，也可能与不同疫苗毒株有不同的免疫原性有关[17-18]。

3.2结论

从检测结果可知，2020年秋季儋州市鸡禽流感 H5以及 H7免疫抗体合格率分别是82%、71%，均符合农业农村部要求的标准。说明 H5和 H7亚型禽流感二联苗的免疫效果较好，有较强的保护力。同时，针对抗体水平不达标的乡镇，建议全面排查原因，及时补免，进一步提高免疫抗体合格率，强化免疫屏障。

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（编辑排版：林海妹）