响应面法优化黑果枸杞多酚超声波辅助提取工艺

代沛珊，李淑玲，杨生辉，朱培龙，刘 帆

（1.河西学院生命科学与工程学院，甘肃张掖 734000；2.河西学院，甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖 734000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）是茄科枸杞属植物，广泛分布于中国西北盐碱荒漠区，是一种独特的药食两用植物。黑果枸杞在藏药中被称为“旁玛”，其味甘、性平、清心热，西藏医药名著《晶珠本草》将其列为传统珍贵名药[1-2]。黑果枸杞蛋白质含量为10.61%；氨基酸种类较丰富；脂肪含量为6.66%，主要脂肪酸为亚油酸、油酸和棕榈酸；矿质元素含量较高，其中钙、铁、镁、铜、锌含量高于红枸杞[3]。黑果枸杞具有抗氧化、抗自由基、保护心脑血管、抗辐射等作用[4]，可直接食用或用作工业原料，还可用于治疗心脏病、高血压、月经不调、更年期紊乱、尿道结合、牙龈出血等[2]。

黑果枸杞富含花色苷等多酚，多酚常采用溶剂提取和超临界萃取等方法，但存在提取时间长、得率低等缺陷[5-6]。超声波提取法依据超声空化效应、机械传质效应和热效应，提高了细胞含量的穿透和传递能力，增大了材料分子的运动频率和速度，提高了有效成分的浸出率。相比于传统提取方法，超声波提取法具有效率高、提取时间短和生物活性不受影响等优点[7]。本研究利用超声波辅助法从黑果枸杞中提取多酚，采用福林酚法测定黑果枸杞中多酚的得率，并通过单因素试验分析了乙醇浓度、固液比、超声时间、超声温度对黑果枸杞中多酚得率的影响，通过响应面试验对提取工艺条件进行了优化，确定了最佳提取条件，为黑果枸杞生物活性物质的研究和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黑果枸杞：采购自张掖新乐超市，用植物粉碎机粉碎，贮藏于密封袋中，避光保存备用。

无水乙醇、碳酸钠、福林酚、硫酸铵购自上海源叶生物科技有限公司，以上均为分析纯。没食子酸标准品（纯度＞98%），上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

722 型可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DKB-501 型数显超级恒温水浴锅，扬州市三发电子有限公司；DL-820E 型智能超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵，巩义市京华仪器有限公司；F2102 型植物试样粉碎机，湖北省骅市中兴仪器有限公司；PL-203 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DD5M型立式大容量离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

准确称取0.5 g 黑果枸杞粉末，按照一定固液比加入一定浓度的乙醇溶液，在超声功率为100 W，一定超声温度下，超声一段时间，提取液在4 000 r/min 离心10 min，量取上清液体积，定容至100 mL，得到样品溶液。

1.3 多酚的测定

采用福林酚比色法测定黑果枸杞多酚含量[8]。取样品溶液0.5 mL，加蒸馏水0.5 mL，加福林酚0.2 mL，反应3～8 min，再加入1 mL 饱和Na2CO3溶液，补水2.8 mL 至总体积5 mL，混匀，黑暗放置60 min，于760 nm 处测定吸光值。

标准曲线的绘制：称取10 mg 没食子酸标准品加蒸馏水定容至100 mL，得0.1 mg/mL 标准溶液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于10 mL 试管中，按照以上福林酚法测定，以没食子酸浓度为横坐标（x），吸光值为纵坐标（y）绘制标准曲线，得回归方程：y=1.933 8x+0.039 1（R2=0.999 2）。根据该方程可得出提取液中黑果枸杞多酚质量浓度，再根据公式（1）即可求出黑果枸杞多酚的得率。

式中，c-黑果枸杞多酚质量浓度，mg/mL；V-上清液体积，mL；N-稀释倍数；m-黑果枸杞质量，g。

1.4 单因素试验

分别考察乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）、固液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、超声时间（5、10、15、20、30 min）、超声温度（30、40、50、60、70 ℃）对黑果枸杞多酚得率的影响。

1.5 响应面试验

在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken 中心组合试验设计原理，选择乙醇浓度（A）、固液比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）进行四因素三水平响应面试验，并以-1、0、1 分别表示自变量的高、中、低水平，多酚得率为响应值，试验因素与水平设计见表1。

表1 黑果枸杞多酚提取Box-Behnken 试验因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken extraction from Lycium ruthenicum polyphenols

1.6 超声波辅助法与传统溶剂提取法的比较

超声波辅助法：采用优化后的超声提取条件提取黑果枸杞多酚。

传统溶剂提取法：准确称取0.5 g 黑果枸杞，按固液比1∶63（g/mL）加入54%乙醇溶液，25 ℃水浴浸提2.5 h。然后，提取液在4 000 r/min 离心10 min，量取上清液体积，定容至100 mL，测量黑果枸杞中的多酚得率。

1.7 乙醇/硫酸铵双水相体系回收黑果枸杞多酚

取2 mL 优化后的提取液考察(NH4)2SO4加入量对多酚回收率的影响：取优化后提取液各2 mL 于10 mL 刻度试管中，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g(NH4)2SO4混匀，在水浴锅中静置1 h，分层后得到上下两相，读取上相体积，并测定黑枸杞多酚在上相的吸光度，再根据公式（2）即可求出黑果枸杞多酚回收率[9]。

式中，V上-上相体积，mL；c上-上相多酚质量浓度，mg/mL；V-优化的提取液体积，2 mL；c-优化的多酚质量浓度，mg/mL。

1.8 数据处理

所有试验平行测定3 次，采用Origin 2019b、Design expert 8.0 软件进行数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对多酚得率的影响

固定固液比1∶40，超声功率100 W，超声时间5 min，超声温度30 ℃的条件下，依次加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，超声波辅助提取黑果枸杞多酚，结果如图1 所示。

由图1 可以看出，当乙醇浓度从30%增加到50%时，多酚得率随乙醇浓度的增加而增大；当乙醇浓度为50%时，达到最大值，为210 mg/g；随后，随乙醇浓度的增加，多酚得率明显降低，这是因为植物体内的水溶性多酚分布在细胞的大液泡中，而非水溶性多酚类物质存在于细胞壁上，且与蛋白质或多糖类物质以氢键结合[10]。低浓度的乙醇溶液可以进入细胞，高浓度的乙醇导致蛋白质变性，阻止了多酚类物质的传质过程，从而降低了多酚得率。因而初步确定提取黑果枸杞多酚类物质的最佳乙醇浓度为50%。

2.1.2 固液比对多酚得率的影响

固定乙醇浓度50%，超声功率100 W，超声时间5 min，超声温度30 ℃的条件下，分别按1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）的固液比进行超声波辅助提取黑果枸杞多酚，结果如图2 所示（见下页）。

由图2 可以看出，随着固液比的增加，多酚得率随之增加；当料液比为1∶60（g/mL）时，多酚得率达到最高，再增加料液比多酚得率反而降低，这可能是因为溶剂过多，不仅增加成本，还会增加杂质的含量。因此，固液比选择1∶60（g/mL）用于进一步优化。

2.1.3 超声时间对多酚得率的影响

固定乙醇浓度为50%，固液比为1∶60（g/mL），超声功率为100 W，超声温度为30 ℃，在超声时间分别为5、10、15、20、30 min 的条件下辅助提取黑果枸杞多酚，结果如图3 所示。

从图3 可以看出，随超声时间的增加，多酚得率逐渐增加，且在超声时间为15 min 时，提取液中多酚得率达到最大值228 mg/g，当超声时间超过15 min 以后，多酚得率开始下降，这是因为长时间的浸提会引起一系列的化学反应[11]，从而引起多酚类物质氧化分解。因此，初步确定最佳超声时间为15 min。

2.1.4 超声温度对多酚得率的影响

固定乙醇浓度为50%，固液比为1∶60（g/mL），超声功率为100 W，超声时间为15 min，在超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃的条件下进行超声波辅助提取黑果枸杞多酚，结果如图4 所示。

图4 超声温度对黑果枸杞多酚得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

从图4 可以看出，当超声温度低于50 ℃时，多酚得率随温度的升高而逐渐增加；当超声温度达到50 ℃时，多酚得率达到最大值，这是因为较高的温度可能会降低溶剂黏度，引起较大的分子运动[12]，从而增加溶解度。之后随温度的升高，多酚得率逐渐减少，原因是随着温度的升高，提取液中部分多酚物质可能发生分解。由此确定最佳超声温度为50 ℃。

2.2 响应面试验

2.2.1 模型的建立及显著性检验

根据表2 中的编码与水平，进行Box-Benhnken 试验设计，以乙醇浓度（A）、固液比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）4 个工艺条件为考察因素，黑果枸杞多酚得率（Y）为响应值，并利用Design expert 8.0.6 软件对试验结果进行分析，结果见表2、3。

利用Design expert 8.0.6 软件对表2 数据进行响应面分析，得到黑果枸杞多酚得率（Y）与自变量乙醇浓度（A）、固液比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）的二次多项回归模型方程如下：Y=230.41+22.66A+27.35B+3.10C+25.75D-2.3AB+5.92AC-2.00AD+6.54BC-8.02BD-8.66CD-29.45A2-32.79B2-25.03C2-20.07D2。

表2 试验设计及结果Table 2 Experimental design and result of response surface method

方程中各项系数绝对值的大小可反映各因素对响应值的影响水平，系数的正负反映了影响的方向。由于该方程的二次项系数均是负的，可推断由该方程表示的抛物面是向下的，具有最大值并可以被优化分析。观察方程的一次项系数可知，影响黑果枸杞多酚得率因素的主次顺序为超声温度（D）＞固液比（B）＞乙醇浓度（A）＞超声时间（C）。对以上模型进行方差分析的结果见表3。

由表3 可以看出，各因素中一次项A（乙醇浓度）、B（固液比）、D（超声温度）对Y（黑果枸杞多酚得率）影响极显著，而C（超声时间）影响不显著；二次项（A2、B2、C2、D2）的P值均低于0.05，说明其对响应值有显著影响，而交互项（AB、AC、AD、BC、BD、CD）的P值均大于0.05，说明其对结果影响不显著。

表3 响应面二次回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

从整体分析，该回归方程的F值为16.18，概率P＜0.000 1，表明模型显著，失拟项F值为1.69，概率P=0.324 4＞0.05，失拟项不显著，表明该回归方程在整个回归区域的拟合情况良好,可用该模型对试验进行分析和预测。R2=0.941 8，说明预测值和实测值之间具有高度的相关性；变异系数c.v.=6.85%，说明该回归方程精密度良好，因此，可用此模型对黑果枸杞中多酚得率进行分析预测。

2.2.2 单因素交互作用

响应面反映的是乙醇浓度、固液比、超声时间和超声温度四个所考察因素中任意两个取零水平时，剩余两个因素相互作用对黑果枸杞多酚得率的影响。从响应面曲线的坡度和等高线的形状可以得出影响黑果枸杞多酚得率的因素之间的相互作用（圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆表示两因素之间的显著交互作用）。黑果枸杞多酚得率与各工艺条件之间的响应面和等高线图如图5～10 所示。

图5 乙醇浓度和固液比对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.5 Interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

图6 乙醇浓度和超声时间对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.6 Interaction of ethanol concentration and ultrasonic time on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

图7 乙醇浓度和超声温度对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.7 Interaction of ethanol concentration and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

图8 固液比和超声时间对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.8 Interaction of solid-liquid ratio and ultrasonic time on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

图9 固液比和超声温度对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.9 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

图10 超声时间和超声温度对黑果枸杞多酚得率的交互影响Fig.10 Interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

由图5～10 可以看出，固液比和超声温度相互作用的响应面曲线最陡，等高线最扁，说明固液比和超声温度对黑果枸杞多酚得率的交互作用最为显著；同理可得，超声时间和超声温度对黑果枸杞多酚得率的交互作用最不显著。

2.2.3 预测值的验证

通过回归模型的预测，超声波辅助提取黑果枸杞中多酚类物质的最佳工艺条件为乙醇浓度53.6%、固液比1∶63.4（g/mL）、超声时间15.3 min、超声温度55.4 ℃，在此条件下，多酚的最大得率为246.238 mg/g。为检验该方法的可靠性，结合操作的便利性，将各工艺条件调整为乙醇浓度54%、固液比1∶63（g/mL）、超声时间15 min、超声温度55 ℃，对修正后的工艺进行三次平行验证性试验，得到黑果枸杞多酚得率的平均值为244.86 mg/g，与模型预测值246.238 mg/g 相比，其相对误差为0.56%，说明该模型有效、可靠。

2.3 超声波辅助提取法与传统溶剂提取法的比较

传统溶剂提取法得到的黑果枸杞中的多酚得率为213.82 mg/g，与超声波辅助法比较，多酚得率下降了14.51%。这是因为超声波的高速、强空化和搅拌作用，促使植物组织细胞破裂或变形，加速了溶剂对样品的渗透，并在溶剂中迅速溶解多酚。

2.4 硫酸铵加入量对多酚回收率的影响

(NH4)2SO4加入量对黑果枸杞多酚得率的影响如图11 所示。当(NH4)2SO4加入量为0.3 g 时，黑果枸杞多酚的回收率达到最高，为80.27%。(NH4)2SO4用量的增加导致析相作用增强，乙醇相中乙醇的相对浓度增大，以及酚类物质在乙醇相中溶解度的增加；当(NH4)2SO4质量浓度过高时，反而会导致无机盐相增大而有机相减小，从而降低黑果枸杞多酚的回收率。

图11 (NH4)2SO4 加入量对黑果枸杞多酚回收率的影响Fig.11 Effect of ammonium sulfate addition on polyphenol recovery of Lycium ruthenicum

3 结论

通过单因素试验和响应面试验得到超声波辅助提取黑果枸杞多酚的最佳工艺条件：乙醇浓度54%、固液比1∶63（g/mL）、超声时间15 min、超声温度55 ℃，对修正后的工艺进行三次平行验证性试验，得到黑果枸杞多酚得率的平均值为244.86 mg/g，与模型预测值246.238 mg/g 相比，其相对误差为0.56%，说明该模型可预测理论得率并用于黑果枸杞多酚提取条件的优化。相比于传统方法，超声波辅助提取黑果枸杞多酚得率提高了14.51%，可显著缩短提取时间，提高效率，提取效果好。