乐山地区竹燕窝不同发育时期的细胞学研究

禹小波，钟胜男，胡 烨，农 向※

(1.竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室(乐山师范学院)，四川 乐山 614000；2.乐山师范学院 生命科学学院，四川 乐山 614000)

0 引言

竹燕窝，学名海绵胶煤炱菌(Scoriasspongiosa)，因其味道鲜美，营养价值高，是一种高档的可食用真菌[1]。竹燕窝除了营养丰富，还具有抗氧化性[2]、抑菌和抗癌等效果[3-5]，因而具有较大的市场潜力。但由于其生长环境较为苛刻，目前市场上供应的竹燕窝仅靠野生采集,尚无人工培育成功的报道。之前的研究表明，海绵胶煤炱菌在PDA培养基(PotatoDextroseAgarMediam)可以生长且易产生分生孢子，但并不能形成大型的子实体[6]。因此，利用PDA培养基对其进行培养虽不具有实用价值，但却为研究竹燕窝的生长发育提供了一个很好的契机。

海绵胶煤炱菌在分类地位上属于子囊菌门，盘菌亚门，座囊菌亚门，座囊菌纲，煤炱菌目，煤炱菌科，胶煤炱菌属。第一份海绵胶煤炱菌标本于1832年被收集并鉴定，编号为Carolina 1311[7]。但之后，国内外有关该菌的研究较少。 研究真菌的生长发育规律，特别是各种细胞类型的分化和细胞命运特化的过程，对于发育生物学而言具有重要的学术价值，同时也对于认识其野生条件下的生长规律及人工培育系统的建立有着重要的借鉴意义。本研究通过对乐山地区的竹燕窝进行采集和菌种分离后，利用PDA培养基对其进行纯培养。通过对竹燕窝各个发育阶段的细胞形态进行了详细的细胞学观察，为后续竹燕窝的生长机制研究和人工培育系统的建立提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

菌种分离的竹燕窝样品来源采样地点：乐山师范学院校内竹林和乐山市莱茵水岸小区竹林。采样时间。2019年11月。

1.1.2 主要试剂

PDA固体培养基，PDA液体培养基，无菌蒸馏水，50%甘油。

1.1.3 试验仪器

Leica DM500光学显微镜，恒温培养箱，高温高压灭菌锅，-80 ℃超低温冰箱，超净台，研钵，镊子，载玻片，锥形瓶，牙签，EP管等。

1.2 试验方法

1.2.1 竹燕窝菌种分离与保存

将野外采集的竹燕窝在超净台上使用无菌水冲洗3次，然后再放入无菌的研钵中研磨粉碎，无菌水重悬，梯度稀释于PDA培养基上，置于24 ℃培养箱中培养至单菌落出现(图1B-D)。将远离细菌污染的竹燕窝单菌落转移到新的PDA培养基上培养至产生分生孢子。使用无菌牙签挑取分生孢子，保存至50%甘油中，-80℃保存。

1.2.2 竹燕窝不同发育时期的光学显微镜观察

对分离的分生孢子使用固体/液体PDA培养基培养，每隔12 h取样进行镜检观察。

2 结果与分析

2.1 竹燕窝的生活环境：竹—蚜—菌三者的共生关系

竹燕窝仅出现在被居竹伪角蚜感染的竹林中，竹燕窝、竹林和蚜虫三者形成了独特的植物-昆虫-真菌的共生关系。其中，居竹伪角蚜(PseudoregmaBambusicola)是一种倾向于感染新生竹的蚜虫。与很多其他昆虫一样，居竹伪角蚜在吸取竹子营养的同时，也会分泌富含糖分的蜜露并导致竹子感染煤污病。这种煤污病的病原菌即是海绵胶煤炱菌。在条件适宜的情况下，煤污病会形成大型的真菌子实体即竹燕窝。虽然很多煤炱科的真菌都会导致煤污病，但在煤炱科中只有海绵胶炱菌能够形成大型的真菌子实体，也是目前报道的该科中唯一可食用的真菌，因而备受关注。

2.2 竹燕窝的菌种分离和形态观察

野生的生长状态良好的竹燕窝呈金黄色珊瑚状分支，富有弹性；衰老黑化的部分则呈黑煤块状，不具弹性(图1A)。使用研磨粉碎的竹燕窝子实体在PDA培养基上24℃培养则会长出晶莹剔透的竹燕窝组织团(图1D)，与野外新生的竹燕窝颜色相同。竹燕窝生长过程的颜色变化规律为：无色透明—浅黄色—金黄色—暗黑色—黑色。

A.竹燕窝取样；B.竹燕窝新生部分子实体； C.研磨粉碎的竹燕窝子实体；D.PDA培养基 生长出的竹燕窝组织团图1 竹燕窝菌种分离过程Fig.1 Isolation of Scorias spongiosa strain

A.竹燕窝组织块，显示菌丝体；B.竹燕窝组织块 开始形成珊瑚状子实体；C.竹燕窝形成大量的珊 瑚状子实体；D.竹燕窝子实体形成分生孢子球， 标尺=100 μm。图2 竹燕窝组织块形态观察Fig.2 Morphological Observation of Scorias Spongiosa Tissues

在显微镜下观察PDA培养基上的竹燕窝，发现其向四周辐射生长出菌丝体，而中间的组织团则类似植物的愈伤组织(图2A)。在PDA培养基上，竹燕窝的菌丝体并不发达，只能局限在组织块周围，形成少量的菌丝(图2A)。组织块可以快速生长并在其表面产生突起，最终发育成为珊瑚状子实体(图2B和图2C)。在PDA培养基上，这些珊瑚状突起最终会分化形成分生孢子器，成熟的分生孢子器会在其顶端形成透明的分生孢子球(图3D)。

A.竹燕窝分生孢子，标尺=20 μm; B.萌发的分生孢子，标尺=20 μm；C.由单个分生孢子发育而来的菌丝体，标尺=100 μm；D.竹燕窝菌丝体在中央开始形成细胞团，标尺=20 μm；E.竹燕窝细胞团变大，并开始分泌胶质物质，标尺=20 μm；F.竹燕窝菌丝体形成管状细胞，标尺=20 μm；G-I.菌丝体形成环状结构，标尺=20 μm；J-L.竹燕窝菌丝体分化出束状细胞，标尺=20 μm。

2.3竹燕窝营养生长的细胞学特性

由于固体PDA培养基上的竹燕窝会产生大量的胶质，不易于观察其生长发育的规律，我们将其接种到PDA液体培养基中，进行培养观察，以减少竹燕窝胶质带来的干扰。在分生孢子球上的分生孢子呈卵形或椭圆形，无色透明，单细胞(图3A)。接种到液体PDA培养基中12 h后，分生孢子的体积迅速膨大并萌发产生菌丝，菌丝呈顶端生长，含中央大液泡(图3B)。分裂数次后的分生孢子最终会形成具有分支的竹燕窝菌丝体，分支的位置一般位于菌丝体的中央部位，而新分裂的细胞则一般不会形成分支(图3C)。继续培养观察后发现，菌丝体倾向于围绕中央，以盘绕螺旋的方式生长并形成致密的细胞团，即子实体原基(图3D)。细胞团原基会迅速扩大并开始积累胶质物质，使组织团呈现淡黄色(图3E)。与此同时，原基周围的菌丝体会随机形成致密的细胞突起(图3F)并最终和其他菌丝体细胞融合交联，形成环形的菌丝体(图3G和图3H)。菌丝体环的交联节点可以为一个或者数个(图3I)。之后，竹燕窝子实体的部分细胞开始分化形成菌丝盘绕的束状细胞，并最终发育成为珊瑚状子实体。束状细胞的下部为疏松细胞，体积较大(图3J)，中部为网状菌丝体(图3K)，上部则为菌丝体盘绕的束状细胞群(图3L)。

2.4 竹燕窝生殖生长的细胞学特性

竹燕窝营养生长的子实体呈典型的珊瑚状(图4A)。在PDA培养基上，子实体会逐渐分化形成分生孢子器，并产生分生孢子球(图4B)。分生孢子球呈白色，具黏性，易从分生孢子梗上脱落(图4C和图4D)。竹燕窝的分生孢子器具长梗，底部呈烧瓶状，向顶端逐渐缩小(图4E)。分生孢子由分生孢子器底部的菌丝产生(图4F)。中间的分生孢子梗由螺旋卷曲的菌丝组成，平行排列，颜色深褐色或黑色，其功能为运输分生孢子(图4G)。分生孢子器顶端由无色透明的菌丝体组成，具开孔，分生孢子器未成熟时关闭，成熟时张开，释放分生孢子(图4H)。

A.竹燕窝的珊瑚状子实体，标尺=500 μm;B.成熟的分生孢子球，标尺=200 μm；C.分生孢子球脱落到培养基表面，标尺=100 μm；D.脱落了分生孢子球的分生孢子器，标尺=200 μm；E.未成熟的分生孢子器整体结构，标尺=100 μm；F.分生孢子器底部菌丝体，标尺=20 μm；G.分生孢子梗菌丝体，标尺=20 μm；H.分生孢子器顶端无色菌丝体，标尺=20 μm

3 结论与讨论

本文通过对乐山地区的竹燕窝进行菌种分离并利用PDA培养基进行纯培养，对其不同发育时期的细胞进行观察分析表明，竹燕窝的生活史为分生孢子—菌丝体—胶质菌丝体—分生孢子器—分生孢子，整个生活史周期中只有无性的生殖过程，未见有性生殖过程。

竹燕窝的分生孢子萌发过程类似顶端生长过程，这一规律与其他丝状真菌的生长规律一致[8]。竹燕窝的菌丝体倾向于在细胞中部位置螺旋盘绕生长形成子实体原基。在这个过程中，菌丝体之间通过相互融合，形成复杂的菌丝体网络，这一过程可能是竹燕窝可以形成大型的胶质子实体是根本原因。值得注意的是，这个过程中菌丝体中部盘绕形成以及交联形成网状结构的细胞学过程是研究细胞融合的良好材料。

在竹燕窝的子实体生长过程中，菌丝体会分泌产生大量的胶质物质，这些物质可能有助于菌丝体原基的聚集或生长，但具体功能还有待进一步探究。由于竹燕窝的主要营养成分、抗氧化物质和抗癌物质都来源于胶质[3-4，9-10]，竹燕窝的胶质分泌的影响因子研究和分泌机制对于提高其营养价值十分重要。有研究表明，使用Tween80和氯仿刺激可以增加其胞外多糖含量的分泌[11]，但由于这些物质为有毒物质，因此无法应用于食品生产中。

在竹燕窝的生殖生长过程中，束状菌丝的形成对于产生分生孢子器是必须的。束状菌丝生长快速，这为细胞学过程为竹燕窝可以形成大量的珊瑚状分枝提供了细胞学依据。有趣的是，并不是所有的束状菌丝都会直接分化产生分生孢子器，部分的束状菌丝产生的珊瑚状分支可以形成二级或三级分支，在野外条件下，这种分支结构使得竹燕窝可以形成独特的大型珊瑚状子实体。在实验条件下不能产生大型子实体可能是由于在PDA培养基上不具备野外的调控因子。

综上表明，本研究对乐山地区的竹燕窝生长发育的细胞学进行了较为详细的观察，对于竹燕窝生长发育的机制研究及进一步开发利用野生竹燕窝资源和人工培育系统的建立提供了一定的理论依据。