基于ITS2序列的藏当归及易混植物DNA分子鉴定

姜钊 色里玛 李捷 陈依春 郝婷婷 孙芳云

摘要：笔者所在实验室长期从事藏药基源鉴定与药物开发，为了确保试验药材的质量及临床安全用药，运用ITS2条形码技术对采自西藏的藏当归及相似植物进行分子鉴定。首先，利用试剂盒提取植物叶片的DNA，对ITS2序列进行PCR扩增，双向测序后运用SeqMan组装。而后，基于ITS2 Database中的Annotate注释方法去掉两端的5.8S区和28S区获得ITS2条形码并预测二级结构，用MEGA 5.0软件进行遗传距离计算并构建系统进化树（NJ）。分析发现，试验中的4种类似植物ITS2条形码间存在明显差异，结合二级结构、遗传距离、进化树位置及形态对比可知其分为3个物种并确定了其分类地位。试验证明，ITS2条形码可有效快速地鉴别易混中药材的种类，为保证其临床用药安全提供了简单、高效、准确的技术手段。

关键词：ITS2条形码;藏当归;系统发育分析;DNA分子鉴定

中图分类号： R282.5  文献标志码： A

文章編号：1002-1302（2021）17-0058-05

收稿日期：2020-12-20

基金项目：西藏民族大学青年学人培育计划（编号：19MDX01）;藏药材基源研究及标准完善（编号：402040003）;西藏自治区自然科学基金（编号：XZ2018 ZRG-86（Z））;香莲祛痛霜的Ⅱ期临床实验（编号：2015XZOIG62）。

作者简介：姜 钊（1990—），男，陕西镇安人，博士，讲师，主要从事藏药材基源研究及分类工作。E-mail：xzmu_jiangz@163.com。

通信作者：孙芳云，教授，主要从事藏药材基源研究及药物开发工作。E-mail：xzmvsfy@ 163.com。

藏当归，学名白亮独活（Heracleum candicans Wall. ex DC.），是伞形科独活属植物，多年生草本，花期7—8月，分布在尼泊尔、巴基斯坦以及我国的云南、西藏、四川等地。白亮独活植物形态与《晶珠本草》等书对珠嘎的叙述相符，具有杀虫、止血、愈疮痈、治麻风的功效，主治各种炎症、麻风、痈疽疔疮（中华本草），还用于治疗风寒感冒头痛、肢节风湿痛、白癜风及各种银屑病（《新华本草纲要》）。藏药学发展至今共1 300多年历史，经典本草书总共6本：《度母本草》《医学四续》《蓝琉璃》《晶珠本草》《甘露本草》《晶镜本草》，而常用植物藏药材就有近1 000种[1]。加之植物形态结构复杂，使得传统的藏药鉴定技术无法准确地进行具体藏药及其混伪品的区分，严重影响藏药的开发，也无法保证藏药的用药安全。笔者所在实验室前期对采自西藏林芝、那曲、日喀则、昌都等地的藏当归进行药效分析试验时发现各地样本药效和外在表型，尤其是根茎的形态都有差异，于是藏当归及混伪品分类地位的确定成为后期药效研究的先决条件，也是藏药开发和利用的重中之重。西藏地区藏当归分布普遍，常分布于海拔2 000～4 000 m，而伞形科以下的分类等级常以果实的形态、有无，脊棱的形态、油管的数目等作为种属的分类依据[2]。Widmer等对独活属形态解剖研究表明，营养体的特征和果实的解剖特征为属以下分类的重要依据[3]。加之有研究表明，独活属及芹亚科内的几个大属均不是单系群。因此，藏当归及相近植物鉴定困难，易混淆。

DNA条形码技术是目前较为纯熟、快速、准确的分子鉴定方法，相较于传统的分类学研究方法更加快速、准确，在中药材的分类鉴定中有着广阔的前景。对于植物鉴定，DNA条形码相对较多，其中有ITS、trnH-psbA、rbcL、matK等 [4-5]，而核糖体DNA的第2内转录间隔区（ITS2）序列由于变异较快，能够较ITS1提供更多的变异位点信息，且其长度不到300 bp，具有结构保守性高等特点，近年来已被提出作为药用植物鉴定的标准条形码序列[6-9]，并且植物ITS2序列在数据库中数据量较大，利于系统比较分析。本试验对采自西藏那曲、林芝、昌都、日喀则4个地区的4种相近外型和药效的植物样品基于ITS2基因进行分子验证，并结合形态结构，探究其分布和物种的多样性，旨在为后期实验室藏药的筛选和研究奠定基础，也为藏药的应用和识别提供更多的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药材由西藏甘露藏药股份有限公司提供，分别采自昌都卡若区城关镇（054）、日喀则康马县南尼乡（055）、林芝波密县扎木镇（056）、那曲申扎县申扎镇（057），样品采集后于-80 ℃保存（表1）。由笔者所在团队“藏药检测技术教育部工程研究中心”相关藏药鉴定专家进行实验室样本形态对比和鉴定，证实采集的4个样点部分植物表型差异明显，为不同种属植物。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

高速离心机（Eppendorf 5810R）;PCR扩增仪（Life）;制冰机（IMS-50）;电泳仪（JUNYI-300）;凝胶成像仪（SAGECREATION）;测序仪器ABI 3730。DNA Marker [天根生化科技（北京）有限公司的D2000，货号：MD114-01];Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、冰乙酸、无水乙醇（海默生物科技有限公司）;植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司DP305];DNA凝胶回收试剂盒（北京擎科新业生物技术有限公司，货号：GE0101-50）;PrimeSTAR HS DNA Polymerase （TaKaRa公司）。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增及测序

将收集的样品洗净并烘干，称取植物叶片干质量约30～50 mg，加入液氮充分研磨成粉末状，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取植物基因组DNA。PCR扩增依照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，采用内部转录间隔区2（ITS2）序列[10]，扩增正向引物 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。扩增体系（25 μL）：5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，正、反向引物各1 μL，模板1 μL，双蒸水14.75 μL。 ITS2序列扩增程序为94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸35 s，33个循环;72 ℃ 延伸 10 min。扩增后，凝胶电泳检测，之后使用DNA凝胶回收试剂盒（GE0101）进行DNA片段的纯化回收并送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.3 数据处理

测序公司返回数据利用SeqMan软件去除引物和低质量序列，并进行拼接。将所有个体的双向拼接序列结果利用Keller等的研究方法[11] （http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）中的Annotate注释并去除两端的58S和28S区段获得ITS2间隔区序列，利用网站中的Predict预测其二级结构。结合二级结构预测结果从NCBI数据库下载相似性较高序列去除两端的5.8S和28S区。采用Clustal X软件[12]进行多序列比对，比对结果通过MEGA 5.0[13]计算遗传距离（K2P）并利用邻近法（NJ）[14]构建系统进化树，采用双参数模型（Two-parameter model），通过Boot strapping进行系统发育树的评估，自展数据集为 1 000 次。

2 結果与分析

2.1 ITS2条形码序列长度、GC含量及序列差异

测序拼接后的序列经过数据库去除5.8S和28S区，4个样品条形码序列的长度为228～229 bp，GC含量为52.4%～57.5%（表1），NCBI下载高相似性序列数据信息见表1。将NCBI收集到的高相似性序列与试验序列一起利用MEGA 5.0做序列间的K2P距离计算，结果见表2。

从表2中可以看出，样品054与其他3个样品的遗传距离为0.175，样品055与056、057的遗传距离为0.216，056与057的遗传距离为0.000;054与相似性最高序列的亮蛇床（Selinum cryptotaenium）的遗传距离为0.009;055与其相似性最高序列的白亮独活（H. candicans）的遗传距离为0.000，同时056和057这2个样品与其相似性最高序列西藏凹乳芹（Vicatia thibetica）的遗传距离也为0.000。说明054、055、056和057分别为3个不同物种，055样品可能为藏当归（白亮独活），056和057可能为同一物种（西藏凹乳芹）。

2.2 系统进化分析

将试验序列及NCBI得到的参考序列共20条序列经过统一去除5.8S和28S区，利用Clustal X进行多序列比对，结果通过MEGA 5.0构建系统进化树（NJ），见图1-A。从进化树中可以看到，4个样品主要集中在3枝，054与伞形科亮蛇床（S. cryptotaenium）聚在一枝，序列相似性为93.75%，可能为一个新种。055与伞形科独活属的白亮独活（H. candicans）聚在一枝，序列相似性为99.96%，该样品可能为白亮独活。056、057的ITS2序列一致，在进化树中与伞形科西藏凹乳芹（V. thibetica）聚在一枝，ITS2序列相似性为100%，056及057号样品应为西藏凹乳芹。

2.3 二级结构分析

将4个样品以及系统进化树中相似度较高且聚在一起的物种的ITS2序列做二级结构比对，见图1-B，054和S. cryptotaenium二级结构有差异，结合系统进化树的位置，054样品可能为亮蛇床属中一个新种;055和H. candicans的二级结构一致，根据其在进化树中的位置、遗传距离及ITS2序列相似性，055样本可能为伞形科独活属的白亮独活（H. candicans），别称藏当归;056、057这2个样本的二级结构与V. thibetica的二级结构基本一致，前期认为该样本可能为牡丹叶当归（Angelica paeoniifolia），但056、057这2个样本ITS2二级结构与牡丹叶当归的二级结构差异较大，并且进化树分布相差较远，因此056、057这2个样本为同一物种，但不是牡丹叶当归，056、057这2个样本属于西藏凹乳芹（V. thibetica），别称野当归。

2.4 形态对比

对比《中国植物志》（FRPS）及《中国高等植物》（HPC）中的描述。亮蛇床（S. cryptotaenium）：植株高达80 cm。根粗壮，多枝根。叶宽三角状卵形，长8～10 cm，宽约8 cm，二至三回羽裂，小裂片长卵形或宽披针形，1～3级深裂或浅裂，小裂片线形。花序径8～10 cm，果序径达20 cm;花序梗长10～20 cm;总苞片2～3片，线形，长约1 cm，密生糙毛，早落;伞辐12～28 cm，长5～7 cm，小总苞片5～10片，线形，长5～8 mm，常向下反曲，密生糙毛。白亮独活（H. candicans）：该植物全株被毛，根圆柱形，茎上部多分枝。基生叶和茎下部叶有长柄;叶宽卵形或长椭圆形，长12～27 cm，一至二回羽裂，小裂片卵形或长卵形，长4～7 cm，宽2.0～4.5 cm，有不规则浅裂和锯齿，下面密生灰白色毛;茎上部叶有宽叶鞘。复伞形花序梗长15～30 cm，总苞片1～3片，线形;伞辐长3～7 cm，小总苞片少数，线形;伞形花序有花约25朵。西藏凹乳芹（V. thibetica）：根圆锥形，长达15 cm。除伞辐基部有糙毛外，全株无毛。基生叶近三角形，长10～15 cm， 三出二至三回羽裂;小裂片长圆形或宽卵形，长1.0～2.5 cm，宽0.5～1.5 cm，羽状深裂或缺刻状;顶部茎生叶细羽裂或3级裂。复伞形花序径5～9 cm，总苞片1片或早落;伞辐8～16 cm，长2～5 cm;伞形花序有花8～13朵，小总苞片4～7片，钻形。

经笔者所在实验室“藏药检测技术教育部工程研究中心”相关藏药鉴定专家进行形态对比并结合ITS2序列的相似性、遗传距离、ITS2二级结构的相似性、系统进化树位置最终确定055样品为白亮独活（H. candicans），别称藏当归。056、057这2个样本属于西藏凹乳芹（V. thibetica），别称野当归。054样品与亮蛇床形态略有差异，根单支，并且054样品ITS2序列相似性、遗传距离和ITS2二级结构都与亮蛇床有差异，因此确定054样品可能为亮蛇床属的一个潜在新种。

3 讨论与结论

藏当归是十大藏药之一，应用较为广泛，但形态相似植物较多，只能根据零散的传统形态进行区分，导致很多其他混伪品被错识而入药，因此在临床和用药过程中十分危险，比如，我国明确提出禁止以欧当归和东当归代替当归入药[15]，因此对入药植物的细分和仔细鉴定十分重要。传统的中药鉴定主要是依靠基原、性状鉴别，植物鉴别需要注重多样的性状，需要长期丰富的经验和理论基础，然而大多数药农和普通人不具备专业知识无法做到精确判断。DNA条形码技术操作简便、准确度高、不受性状限制，可以为药材的准确鉴定提供依据。

笔者所在实验室采集大量的西藏藏药植株样本进行药用成分分析，但部分植物由于表型接近无法仔细区分，在藏当归的药效研究中，对采自西藏4个地区具有丰富黄酮类化合物的植物样本进行分子分类鉴定并结合《中国植物志》和《中国高等植物》中相关植物的形态学对比，最后确定了054样品可能为亮蛇床属中潜在的一个新种，055样品为白亮独活（H. candicans），别称藏当归。056、057这2个样本属于西藏凹乳芹（V. thibetica），别称野当归。

西藏藏药植物资源较多，潜在植物多样性丰富，相似药效、相似表型植物容易混淆，这为精确的藏药研究和开发增加了难度，为保证试验研究和药物开发资源的准确性，DNA条形码等分子手段随着相关数据库的完善操作简单、比对迅速，可为后期形态学的对比缩小范围，并提供更多的比较依据。后期可以广泛利用DNA条形码对区域内植物进行验证，结合形态学比较，为后期藏药的鉴定以及临床的安全应用提供快速、准确、多维的鉴定技术保障，也为其他植物的鉴定和研究提供参考。

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