储粮害虫低氧应答机制的研究进展

崔素芬 鲁玉杰 刘志诚 邱江平

(江苏科技大学粮食学院1，镇江 212100)(上海交通大学农业与生物学院2，上海 200240)

氧气是好氧生物利用有氧呼吸产生ATP的必需物质。当氧气不足时，呼吸代谢被抑制，ATP产量减少，活性分子增多，引起机体氧化应激反应，致使组织损伤甚至死亡[1]。气调储粮技术即是利用这个原理，在密闭仓储环境中隔绝外界O2或者人工充入N2或CO2降低O2比例，达到害虫防治、绿色储粮的目的[2]。气调储粮是我国未来生态储粮的重要方式之一，目前已在绵阳、南京、上海、九江、苏州等粮库推广应用[3]。

然而，经过长期进化，昆虫形成了较强的低氧抗性，给这项技术带来挑战。现实证明，一些鞘翅目、鳞翅目、直翅目、双翅目、等翅目昆虫等可以从数小时甚至数天缺氧中恢复[4-7]。在气调储粮时，将氧气体积分数降至2%～5%、维持2～3个月可以有效地控制害虫发展，当氧气浓度恢复时，害虫可能再次爆发[8-10]。这种能力在哺乳动物中罕见。因此，揭示昆虫低氧适应机制，有助于推动气调储粮技术广泛应用、构建新型害虫防治策略。现对储粮害虫低氧适应策略及相关机制进行综述。

1 储粮害虫低氧应答策略

生物通过行为趋避、组织改变、代谢重构、基因调控、遗传变异等策略，形成了较强的低氧适应性。

1.1 昆虫改变生物学行为适应低氧胁迫

当短时间低氧处理时，昆虫及时调节气孔开闭、增加腹部蠕动以暂时获取外部氧气；当仍不能满足氧气需求时，昆虫抑制觅食、生长发育、繁殖行为，降低ATP所需，降低组织过氧化性损伤。另外，昆虫可以调整食物结构，提高能源物质摄入比例，减少不必要的能量消耗。例如，四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)、绿豆象(Callosobruchuschinensis)、粉斑螟(Ephestiacautella)等昆虫被低氧处理后生长发育减缓或停止，繁殖能力下降，但是子代孵化率却提高[11-14]。这表明，气调储粮时，需将粮仓内氧气降至极低，且维持足够长时间才可充分抑制害虫种群繁衍。

1.2 昆虫改变组织形态适应低氧胁迫

当长时间低氧处理时，昆虫通过改变细胞、体型体积大小，气管系统结构等补偿性策略来提高抗低氧胁迫能力[15,16]。当一些非脊椎动物或靠体表呼吸的脊椎动物体型增大，气体交换效应减弱。因此，低氧耐受型赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)等昆虫体型减小，有利于提高气体交换效应即氧气利用率[17,18]。

随着形态学表征设备及技术提升，昆虫体型大小、气管结构等表型变化被直观地体现。例如，利用 X线源相位对比技术，发现体型较大的昆虫将身体大部分用于气管系统，表明气管投入与昆虫体型大小成正相关[19]。低氧条件下，昆虫气管系统内大型多细胞传导气管(直径<2 mm)和微小型气管(直径>90 nm)结构变化情况被逐步揭示。例如，利用同步辐射计算机断层扫描技术(SR-μCT)、共焦显微镜分析，发现果蝇飞行肌内气管形态补偿变化主要发生在小的、远端气管和微气管，而那些主分支和次分支气管变化不明显。此时，这些气管直径变大、分支增多，线粒体内气管投入增加、气管容积比增大，增加氧气供应、减小ATP损耗，提高昆虫低氧适应性[16,20]。昆虫气管分支过程具有高度可控性和保守性。某些糖基水解酶、disc生长因子等在果蝇气管几丁质-角质层合成与分解、维持管道功能稳定过程起关键作用[21]。因此，深入分析这些因子对气管组分影响，将有助于揭示低氧条件下昆虫气管结构稳定性和可塑性机制。

1.3 昆虫调整分子代谢适应低氧胁迫

生物表型发生变化时，必然伴随着一系列分子代谢水平的变化。近年来， “组学”技术的发展为揭示一些非模式种如储粮害虫低氧适应机制提供了便利。在低氧条件下，有氧代谢被抑制，厌氧代谢被激活，供应ATP和能量，同时生成大量的代谢产物。其中，一些物质如乳酸、丙氨酸、琥珀酸盐、苹果酸盐、乙醇、柠檬酸、醋酸盐、甘油-3 磷酸盐等易对昆虫造成过氧化性损伤；而一些物质如肌醇、山梨糖醇、亚油酸、络氨酸、色氨酸、脯氨酸、谷氨酸、4-氨基丁酸、甘油、甘露糖、木糖醇等可能有利于昆虫适应低氧环境[12,22]。此时，葡萄糖的利用率提高，每分子葡萄糖生成ATP增多、电子减少[23]。

昆虫发育阶段不同，分子代谢响应机制有可能不同。研究发现，在缺氧条件下，果蝇成虫体内木糖醇、甘露糖醇、甘氨酸、牛磺酸等保护性物质的含量明显增加；而幼虫体内甘露糖、木糖醇、甘油、丝氨酸、络氨酸等物质明显减少[24]。这说明，昆虫根据需求来调控最初代谢方向、增强环境适应能力。成虫阶段侧重于增加保护性物质、提高免疫防御能力，而幼虫阶段更倾向于增加能量、抗氧化代谢、与变性蛋白绑定等相关物质，为后续生存、发育做准备。

一些关键的代谢物功能及调控机制正在逐步被揭示。研究发现，琥珀酸盐的累积，除了带来组织缺血再灌注性损伤以外，激活低氧诱导因子(Hypoxia inducible factors，HIFs)信号途径，诱导气管重塑，使昆虫在低氧条件下生存几天甚至几周时间[25]。因此，琥珀酸脱氢酶变化也会影响抗低氧胁迫过程。例如，低氧耐受型果蝇线粒体内琥珀酸脱氢酶活性降低，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产量降低，且伴随着复合物Ⅰ和Ⅲ活性提高、复合物Ⅱ活性降低等生理现象[26]。琥珀酸脱氢酶等位基因调节昆虫代谢率变化、HIF信号途径激活，影响气管发育、氧气输送、生存状况以及种群繁衍等生物过程[27]。除琥珀酸以外，其他代谢产物如ROS、α-酮戊二酸等对生物低氧适应性的调控机制正被逐渐揭示[28]。

1.4 昆虫改变基因表达模式适应低氧胁迫

当代谢水平发生改变时，往往伴随着转录水平改变。大量研究表明，昆虫体内大部分糖酵解基因表达量上调，线粒体代谢被抑制，一个转录因子hairy被诱导产生，抑制下游三羧酸循环(TCA)代谢通路的基因表达；一些关键消化酶编码基因及其酶活性降低。涉及Notch、Toll/Imd、表皮生长因子(EGF)、胰岛素受体、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信号途径的基因表达量上调或被诱导产生，相关信号通路及效应分子被激活[5,18,29,30]。这些信号途径的激活、细胞呼吸蛋白调控、代谢酶多态性差异性变化等，不仅对提高昆虫低氧适应能力至关重要，可能在保护哺乳动物免受低氧损伤方面也发挥了关键的作用。

基因表达模式往往随着物种、龄期和处理方式改变。例如，经低氧筛选获的低氧耐受型果蝇在成虫、幼虫基因变化情况差异明显，其中，幼虫体内差异基因(DEGs)比成虫DEGs多；仅有少量DEGs同时出现在成虫和幼虫体内，大部分上调基因涉及免疫蛋白，下调基因涉及代谢酶类[18]。这也解释了“成虫与幼虫在低氧响应时代谢倾向的不同”。同样，在不同处理方式如连续低氧(CH)和间歇低氧(IH)，昆虫基因数目和种类也存在明显差异[31]。基因表达也受物种影响。上述研究也表明，赤拟谷盗、四纹豆象、绿豆象等低氧响应不同，基因表达模式也存在差异。在低氧条件下，绿豆象体内涉及TCA循环大部分基因表达量增加，这与滞育果蝇情况相似，与四纹豆象情况相反[32]。

目前，一些低氧响应基因如呼吸蛋白、线粒体氧化酶c、热激蛋白、TCA循环相关酶、铁氧还原蛋白等变化对生物低氧适应性有影响，具体功能正在不断揭示中。例如，呼吸蛋白(Glob)被认为与氧气供应有关。低氧时，Glob在大多数脊椎动物和水生生物如摇蚊(Chironomusspp)表达量增加；而果蝇Glob1基因表达量却降低，在恢复常氧时表达量升高[33]。另外，研究还发现，Glob与卵细胞形成有关，并且可能受HIF调控，但是具体功能及调控机制仍不清。基于“组学”研究思路，利用已获得低氧响应基因或代谢物，通过构建共表达分析，可以快速获得关键调控因子即未来新型防治策略靶标位点，进一步揭示该调控因子的作用机制。

2 低氧应答调控机制

目前，关于昆虫低氧抗性机制的研究多以模式生物为对象，针对非模式类储粮害虫的相关研究较少。无论脊椎或非脊椎动物的生长发育过程具有高度保守性和可塑性。因此，大量关于模式生物的相关研究必将为揭示储粮害虫低氧应答调控机制提供基础和参考。将昆虫低氧应答调控模式分为两大类：HIF依赖型和非HIF依赖型调控模式。

2.1 HIF依赖型调控模式

近30年来，HIF一直被认为是生物低氧转录应答响应的关键调控因子。HIFs是一系列具有碱性螺旋-环-螺旋/时钟-芳香烃受体核转位子-专一性蛋白结构域(bHLH/PAS)结构的蛋白，由α和β亚基构成，具有高度保守性。果蝇与哺乳动物HIFα和HIFβ同源的基因分别是sima和tango，在线虫(Caenorhabditiselegans)体内分别是hif-1和aha-1。常氧时，HIFα亚基在脯氨酰羟化酶(PHD)和天冬氨酰羟化酶(FIH)作用下发生羟基化后，迅速与希佩尔-林道蛋白(VHL)结合而降解。低氧时，HIFα增加，转运至细胞核与HIFβ形成异源二聚体(HIFα/ARNT)后，与低氧响应元件(Hypoxia responsive elements, HREs)绑定、诱导下游靶标基因表达，调控生长发育、新陈代谢、血红蛋白合成、气管重塑等[34,35](见图1)。

图1 HIF信号途径调控模式

除了HREs以外，低氧响应基因序列中还存在其他顺式作用元件，协同调控RNA转录起始和效率。例如，除HREs以外，四纹豆象HSP27、HSP21基因序列还存在热休克元件(HSES)、CREB、GATA2、TATA等其他顺式元件，它们与相应的转录因子结合调控HSP表达，如HSP启动子序列中HSEs与热休克转录因子HREs与HIF结合等共同诱导HSP表达，提高四纹豆象低氧适应能力[5]。这些顺式作用元件与转录因子结合效应，影响HIF在低氧响应基因表达与调控过程中的功能。随着研究深入，越来越多低氧响应基因被发现与HIF功能相关，这些基因序列结构、功能逐渐被揭示。例如，组蛋白脱甲基酶-2(KDM2)，一类人类癌症中的解除管制因子，在果蝇、人类细胞中广泛存在。研究证实，低氧时，KDM2启动子与HIF1绑定后，共同参与调控果蝇低氧适应过程、人类癌症细胞发育过程等[36]。

HIF发挥功能取决于HIF1α亚基与VHL蛋白绑定过程，与氧感受器(PHD和FIH)活性密切相关。在低氧条件下，PHD催化脯氨酰基(Pro402和Pro564)，FIH天冬氨酰基(Asn803)发生羟基化反应。已知PHD和FIH活性受到多种因子影响(见图2)。一些因子发挥正调控作用，如O2、Fe、VC等增加PHD2活性，降低HIF1α稳定性；一些因子发挥负调控作用，如ROS、NO等抑制PHD2活性，提高降低HIF1α稳定性，而PHD2是HIF1α负调控因子[18,34,37]。

注：“+”表示正调控，“-”表示负调控。图2 生物体内各因子对HIF功能调控关系图[35]

大部分调控因子的产生与线粒体功能有关。线粒体是重要氧气感受器，对生物低氧响应起着触发器的作用。低氧时，线粒体内代谢发生重构，氧化还原电位发生改变，调控胞质信号通路以防御低氧应激损伤。线粒体呼吸电子传递链(ETC)构成部分如细胞色素C复合物Ⅲ、复合物Ⅰ，Reike-iron硫蛋白、线粒体DNA、ATP合酶活性抑制因子1(ATPIF1)等，有助于HIF蛋白稳定；线粒体内氧化还原电位、Fe2+、O2、代谢产物如TCA代谢产物、ROS、NO、VC、等，调控PHD活性，调控细胞内信号通路适应低氧胁迫[38]。这些因子的调控功能正逐步被研究。例如，在线粒体内，谷胱甘酸在谷氨酰胺酶作用下生成后，进入TCA循环，通过α-酮戊二酸转换成琥珀酸，脂多糖(TLPs)累积，从而激活HIF功能[39]；TCA代谢产物柠檬酸盐被输送至细胞核生成胞质乙酰辅酶A，调控蛋白乙酰化，引起细胞信号通路核及表观遗传状态[40]；线粒体代谢生成ROS，通过氧化信号蛋白结构中半胱氨酸残基硫醇基团，调控细胞增殖、分化以及低氧胁迫[29]。

另外，一些调控因子属于多蛋白复合物Branma/SWI/SNF、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/雷帕霉素信号靶点(TOR)、真核起始因子2(elF2)和真核翻译延伸因子2(eEF2)等，在HIF功能调控过程发挥重要的作用[41]。可见，HIF功能受多个不同因子协同调控。例如，sima和tango是果蝇HIF重要的调控因子，当敲除sima和tango功能时，Fatiga和IDH表达量明显下降[42]。Fatiga是PHD氧受体之一，它通过调控HIF/Sima功能，影响昆虫生长发育过程。当Fatiga缺失时，果蝇蛹、细胞体积变小；当Fatiga过表达时，果蝇成虫翅膀细胞体积增大；当fatiga和sima基因同时过表达时，蛹的体积不变；另外，当fatiga过表达时，果蝇成虫过度生长，但是HIFs蛋白表达量却无显著提高[43]。据猜测，fatiga可能通过一种不依赖于Sima/Tango信号途径调控生长发育，但是具体调控模式仍未知。

2.2 非HIF依赖型调控模式

尽管HIF1激活作用具有一定的共性，但不同生物体的低氧耐性却有很大差异。在低氧条件下，大部分低氧敏感性高的生物试图补偿ATP需求，而耐低氧的生物则减少ATP的供应和消耗[44-46]。这表明，除了HIF1以外，其他调控因子也参与了生物低氧适应过程。野生型与HIF1缺失型线虫mRNA低氧应答情况相比基因表达量变化明显[47]；昆虫热激蛋白被诱导产生需HIF1，而气管末端向氧气匮乏区补偿发育则需HIF1和不依赖HIF1的组分协同作用等，进一步验证了HIF1并不是唯一的低氧应答调控途径[5,48,49]。在低氧条件下，NO/cGMP/PKG信号途径被激活，通过诱导下游线粒体ATP敏感型钾离子通道(KATP)，启动细胞适应性保护机制，降低昆虫细胞死亡率[50]；转录因子(FOXO)被诱导产生，调控下游葡萄糖代谢影响昆虫低氧抗性；先天免疫转录因子NF-kappa B/Relish(FOXO靶标因子)及下游靶标基因被诱导产生；FOXO、Relish编码基因被敲除时，昆虫死亡率提高[51]；当TORC1途径受抑制，脂肪体内脂质代谢受干扰，昆虫生长发育减缓[5]； Wnt途径被激活时，低氧耐受型果蝇成虫羽化率提高；在肿瘤细胞里Wnt途径也被激活[52]。Warts是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，具有抑制细胞生长调控功能，当Warts基因功能缺失、胰岛素受体基因过表达时，气管重塑加剧、氧气供应量增加，低氧耐受性增强[15]。研究表明，除上述因子以外，Toll、JNK、Notch、胰岛素受体、络氨酸受体等参与了昆虫低氧适应过程，具体调控机制正在研究中[18,53-55]。

2.3 其他

除了与HREs绑定以外，HIF与其他转录因子，共同调控生物低氧适应过程。例如，激活AKT-mTOR-HIF1α信号途径，有助于增强细胞内糖酵解反应过程[56]。将埃及伊蚊(Aedesaegypti)肠道感染大肠杆菌后发现，组织内HIFα增加，HIF信号途径启动，同时下游胰岛素/胰岛素类生长因子(IGF-1)被激活，腺苷单磷酸激酶(AMPK)信号途径被抑制，协同调控幼虫生长与代谢过程[36]。HIF与其他转录因子结合、调控靶标基因表达的过程受磷酸化和亚硝基化水平影响[57]。随着“组学”、分子生物技术发展，昆虫低氧应答调控过程将被逐步揭示。

3 总结与展望

尽管气调储粮技术可以有效抑制害虫种群发展，然而储粮害虫较强的低氧适应能力给这项技术实质应用带来了挑战。在长期密闭环境中，储粮害虫形成了一系列策略如改变生物学行为特征、组织结构、代谢与转录水平等来适应低氧胁迫。在这个过程中，多种信号转导因子参与并发挥了重要调控功能。其中，低氧诱导因子(HIF)在诱导低氧响应基因表达，调控昆虫生长发育、免疫、气管重塑等过程发挥了关键作用。除HIF以外，Toll、NF-κB/、JNK、Notch、肿瘤抑制蛋白、SP因子、NO/cGMP/PKG、mTOR、Wart、FOXO等因子也发挥了重要的作用。这些调控因子彼此影响，共同参与调控昆虫低氧适应过程。

目前，国际上关于昆虫低氧适应性机制的研究多以模式生物如果蝇为对象，而以非模式类储粮害虫为研究对象的罕见。尽管它们会共享一些保守途径，但是不同的生活方式、种类的昆虫低氧响应过程也存在不同。转录组学分析表明，赤拟谷盗、四纹豆象、绿豆象等储粮害虫低氧适应时，基因表达模式与果蝇存在明显差异。通过筛选关键调控因子或关键靶标基因，分析相关调控途径，进一步揭示储粮害虫低氧适应性机制、弥补昆虫低氧抗性研究的不足，为构建新型害虫防治策略甚至人类癌症治疗提供有效靶标提供依据和参考。