现代无损检测技术在农产品真菌与真菌毒素侵染中的应用

2021-09-26穆渴心

中国粮油学报 2021年8期

穆渴心蔡俊刘枣张佳

(湖北工业大学，武汉 430070)

真菌可侵染多种初级农产品，不仅影响人畜健康，同时可造成大量经济损失。真菌毒素是一类由真菌在生长繁殖过程中产生的次生有毒代谢产物，具有较强的稳定性，易进入食物链，造成人畜患病甚至死亡[1-3]。基于真菌与真菌毒素特性及其在农副产品中广泛分布的特点，目前已经开发了薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)[4]、高效液相色谱-串联质谱(High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS)[5，6]、液相色谱-串联质谱(Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LC-MS)[7]、酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)[8]、胶体金免疫技术(Colloidal Gold Immunochromatography)[9]等多种分析方法用于食品和农产品中真菌与真菌毒素的测定[10]。HPLC-MS、LC-MS、TLC等理化方法的结果准确、灵敏，但通常耗时长、破坏性大，不适合在线应用。ELISA、胶体金技术等属于免疫学方法，特异性较强。但ELISA操作步骤繁琐、对检测人员的技术要求较高。胶体金技术其胶体溶液的稳定性较差、存放时间相对较短及灵敏度受到多种因素的影响。近年来，随着多种现代无损检测技术的发展，在真菌与真菌毒素领域，已有近红外光谱(Near-infrared spectroscopy，NIRS)和中红外光谱(Mid-infrared spectroscopy，MIRS)、电子鼻(Electronical nose，EN)、高光谱成像(Hyperspectral imaging，HSI)、荧光光谱法(Fluorescence spectroscopy，FS)和太赫兹时域光谱(THz time-domain spectroscopy，THz-TDS)应用于不同的农产品中真菌和真菌毒素的检测研究，本文综述了不同分析方法与化学计量学算法的结合应用，并讨论了无损检测技术结合化学计量学方法检测真菌毒素技术的未来趋势和挑战。

1 真菌及真菌毒素

农产品易被曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)和链格孢属(Alternaria)侵染。产生的真菌毒素包括黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFs)、赭曲霉毒素 (Ochratoxin)、赭曲霉毒素包含OTA、OTB、OTC、展青霉素(Patulin，PAT)和镰刀菌属毒素(Fusarium toxins)，镰刀菌属毒素包括单端孢霉烯族化合物(脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON、雪腐镰刀菌醇、3-乙酰-DON、15-乙酰-DON、T-2和HT-2毒素以及其他化学相关化合物)、伏马菌素(Fumonisins，FB)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZON)和玉米赤霉烯酮衍生物(Zearalenone derivatives，ZONs)等，目前共发现真菌毒素400余种[11]。

其中，AFB1已被国际癌症研究机构列为第1类致癌物。黄曲霉毒素可造成机体肝脏和胆囊癌变、致畸、致突变；OTA和橘霉素可造成肾脏病变；DON和PAT可造成胃肠道病变；FB和链格孢菌毒素可引起人体食道癌[12，13]。农副产品中真菌和真菌毒素的分布不均匀，且难以从粮食等农副产品中分离[14]，增加了检测难度，因而需要无损、快速的检测手段。

2 快速无损检测方法

2.1 近红外光谱(NIRS)和中红外光谱(MIRS)

作为农副产品理化性质检测技术，NIRS和MIRS以其高效的优势逐步成为广泛应用于产毒真菌和真菌毒素快速无损检测的手段[15]。Tripathi等[16]采用偏最小二乘回归模型对含AFB1(15～500 μg/kg)的红辣椒粉漫反射率数据进行了定量检测，验证了MIRS检测AFB1含量的可行性。Moscetti等[17]将板栗3个不同部位的漫反射光谱数据融合，将重度霉变、中度霉变、对照组完全分开，分类准确度高达97%。Durmus等[18]为鉴别黑曲霉侵染的无花果，采用NIRS成功区分出侵染与未侵染的无花果，并发现200～1 100 nm含有特征信息较多。Zheng等[19]发现，黄曲霉毒素产生的前体物质为杂色曲菌素，通过对杂色曲菌素的检测，可以预警黄曲霉毒素的产生，其定量模型采用极端梯度提升算法，均方根误差为3.57 μg/kg。

波长筛选是常用的提高检测效率的方法。Teean等[20]以1 120、1 300和1 650 nm作为特征波长对感染不同时间黄曲霉的水果进行了分类，得到91%～100%不等的分类精度，发现二次判别分析分类精度高于线性判别分析。Williams等[21]利用NIRS收集被真菌侵染的玉米粒光谱数据，选取1 405 nm(淀粉的特征吸收)、1 660 nm(芳香结构的特征吸收)、1 900 nm(淀粉的特征吸收)、2 136 nm(蛋白质的特征吸收)作为特征波长进行PLS分析，在包含时间变量的模型中发现玉米粒腐败程度与侵染时间存在正相关关系，R2为0.98。

NIRS和MIRS可以采用透射、漫透射、漫反射等各种光谱测量方式，反射光谱可以收集被侵染的农产品的表面信息，透射光谱则可以获得样品的内部特征信息[22]。建模方法中，已经普遍认为非线性方法比线性方法具有更强的模型适应能力。同时，运用合适的波长选择算法，如竞争性自适应重加权、随机森林、连续投影算法等[23]可筛选出含有特异性信息较多的波长，对复杂信息变量进行优化，简化模型。

2.2 电子鼻(EN)

考虑到不同气敏传感器的特异性，采用多特征融合表征的模型构建方法，可以提高EN的预测能力[30-32]。郝银凤[33]研究了多特征组合表征测定AFB1、ZON、呕吐毒素含量，结果显示基于核变换 FDA的 BPNN误差均小于 0.6%。

利用EN对真菌毒素直接进行分析的研究相对较少，目前EN主要用于产毒真菌的检测，对真菌毒素含量较低的样本进行定量时需要改良或优化仪器[34]。

2.3 高光谱成像(HSI)

HSI是集合了光谱与图像的新型分析技术，能够同时收集样本的光谱和空间特性，获得内外部的品质信息，因而可以用于检测粮油中的真菌和真菌毒素[35]。

Kimuli等[36]采用VNIR-HSI收集了400～1 000 nm范围内含AFB1为0.003 3～0.5 μg每粒的4个浓度梯度共600粒玉米粒的光谱，应用PCA进行数据降维，Fisher线性判别分析进行分类预测，准确率>96%。Kheiralipour等[37]利用NIR-HSI检测开心果中的AFB1，发现QDA对不同菌种和不同时期的健康籽粒和感染籽粒的分类准确度更高。Barbedo等[38]将DON污染的小麦按照不同浓度分类，二分类准确率为81%，三分类准确率为72%。Chu等[39]采用短波红外高光谱成像技术对玉米中AFB1浓度<20 μg/L、20～100 μg/L、≥ 100 μg/L进行了检测。选取1 317、1 459、1 865、1 934、2 274 nm作为特征波长进行模型简化，支持向量机准确率为82.5%，R2=0.70。

HSI相较二维光谱技术可获取更多有效信息，但由于HSI属于3-D “数据立方体”[40]，其中包含了大量冗余数据，因而在应用时需挖掘有效信息。此外，HSI不适用于液体或均质样品，因为高光谱的成像功能旨在可视化空间异质性[41]。

2.4 荧光光谱法(FS)

FS是一种利用物质荧光性质进行无损检测的方法。激光诱导荧光(LIFS)、单光子诱导荧光在真菌毒素检测中应用较广泛[42]。AFB和AFG在受到紫外线照射时会产生青黄色荧光(Bright Greenish Yellow Fluorescence，BGYF)，这使得FS分析黄曲霉毒素的侵染成为可能[43]。Smeesters等[44]应用单光子诱导荧光和双光子诱导荧光光谱对AFB1侵染的玉米进行了检测，发现在365、 405、 730、 750、 780、810 nm波长下，被侵染的玉米和未被侵染的玉米均存在光谱差异，其中，365 和780 nm波长下的光谱差异最大。Yao等[45]利用FS对AFB1污染的玉米粒进行检测，采用两种分类算法(最大似然法和二进制编码法)，将玉米粒分为“对照组”和“污染组”。准确率分别为87%和88%。Davis等[46]应用FS对AFB1含量<15 μg/kg与AFB1含量>15 μg/kg的花生样本建立模型，识别准确率超过80%。Smeesters等[47]发现荧光光谱下，AFB1含量<1 μg/kg与AFB1含量>70 μg/kg的玉米粒在400～550 nm内可完全分开。

LIFS已成功地用于农产品中痕量真菌毒素的测定。Wu等[48]采用LIFS对2种开心果中的AFB1进行了检测。标准正态变换结合二阶导数对混合样品AFB1污染具有良好的判别能力(精度≥98.4%)。这些结果初步表明LIFS对人工污染AFB1的样本进行筛选是可行的，但对天然污染样品的性能还需要进一步的研究。

学者已经验证了LIFS检测AFB1的可行性，但仍然存在一些问题。首先，目前只进行了自建LIFS系统的静态实验，无法满足实际在线检测分析的高通量要求[49]。其次，早期的研究主要集中在单一探测器的LIFS，一个激光探头和一个探测探头，很难收集样本的全部信息。此外，由于样品本身表面不均匀所产生的散射效应，单个探测探针无法获得完整的荧光信号。近年来，有学者采用高性能相机结合双重紫外线激发光源收集玉米样品的荧光图像，单波段荧光数据(436 nm和532 nm)结合图像数据用于分析样本中黄曲霉毒素，实现了高速、大批量筛选，并获得了较高精度的检测结果[50]。为增强荧光信号，有学者尝试增加生物传感器或对待测物进行富集等方法，均获得了较好的实验结果[51]。

2.5 太赫兹时域光谱(THz-TDS)

太赫兹波是0.1～10 THz的电磁波，对应辐射频带范围为30～3 000 μm。THz波介于微波与红外辐射之间，相比短波的红外光，太赫兹波具有更高的穿透性[52]。太赫兹辐射的光子能量较低(1 THz的能量为4 meV)属于非电离电磁波，非电离形式的THz波不会破坏活细胞的组织和生物分子结构，因而可应用于生物医学[53]、包装商品检验[54]、食品检验[55]、水污染检测等领域[56]。

THz-TDS是最常用的太赫兹光谱技术[57]。Ge等[58]对乙腈溶液中AFB1进行了测定，采用线性(PLS、PCR)回归模型和非线性(SVM、PCA-SVM)回归模型，在0.4～1.6 THz的频率范围内，采用THz-TDS定量测定乙腈溶液中AFB1的浓度。结果表明，AB1浓度为1～50 μg/L时，非线性回归模型优于线性回归模型。Liu等[59]用太赫兹光谱法结合化学计量学测定大豆油中的AFB1，发现BPNN结合T-SNE 检测结果最佳(R2=0.994 8， RMSEP=0.712 4 μg/kg)，对于AFB1质量浓度低于1 μg/kg的大豆油进行检测的准确率高于90%。

作为基于光谱技术的新兴检测手段，太赫兹光谱技术有一定的应用限制。第一，太赫兹辐射与生物分子间具有一定的相互作用，可以从微观水平上解释生物分子对太赫兹波的吸收规律，但需要运用有效的数据分析方法降低信号噪声，提高信噪比。第二，改进太赫兹光谱仪器的硬件设备，如超材料，可提高太赫兹光谱的应用范围，增强仪器敏感性，提高分析准确率[60]。