响应面优化超临界CO2萃取韭菜子油工艺研究

2021-09-26林小华叶惠娴徐巧钰许赞杉

中国粮油学报 2021年8期

林小华叶惠娴徐巧钰许赞杉

(厦门医学院药学系1，厦门 361023)(厦门市中药生物工程重点实验室2，厦门 361023)

韭菜子是我国传统中药材之一，为百合科葱属植物韭菜的干燥成熟种子，具有温补肝肾、壮阳固精的功效，主要用于治疗肝肾亏虚、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、白浊带下等多种病症[1]。大量药理研究表明韭菜子具有：改善性功能的作用、治疗遗尿的作用、增强免疫的作用以及治疗呃逆的作用等[2-6]。少量研究报导了韭菜子烟熏能治疗牙痛的作用、韭菜子油具有抗高温和抗低温的作用以及韭菜子水提取物具有耐缺氧和抗疲劳作用[7-9]。目前对韭菜子油的提取研究主要采用水蒸气蒸馏法[10]。与传统的方法比较，超临界 CO2萃取具有萃取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低、无溶剂残留，可减少萃取过程中不饱和脂肪酸的氧化，适合不稳定、易氧化的挥发性、脂溶性成分提取分离。本研究采用超临界CO2萃取技术提取韭菜子油，在单因素实验基础上，借助实验设计软件 Design-Expert(V12)，采用Box-Behnken响应面法对影响韭菜子油萃取工艺条件进行优化，建立超临界CO2萃取韭菜子油的数学模型，并采用GC-MS对韭菜子油的成分进行分析，以期为韭菜子油的充分利用和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

韭菜子：置于60 ℃烘箱中干燥后，粉碎并过40目筛备用；CO2气体：纯度>99.99%；乙醇：分析纯。

1.2 仪器

PU-2086-CO2型超临界萃取仪，Agilent7890B-7000B型气相色谱-质谱/质谱联用仪，RT-04型多功能粉碎机，BS224S型精密分析天平，DHG-9055A型电热恒温鼓风干燥箱。

1.3 试验方法

1.3.1 韭菜子油超临界CO2提取工艺流程

韭菜子→烘干→粉碎→过筛(40目)→称重→超临界CO2萃取→分离→韭菜子油

1.3.2 单因素试验设计

分别以萃取压力、萃取温度、萃取时间为变量，以韭菜子油提取率为评价指标，进行单因素试验，确定各影响因素的适宜范围。1)萃取压力对韭菜子油提取率的影响：选取萃取温度40 ℃，分别在15、20、25、30、35 MPa萃取2.0 h，考察压力对韭菜子油提取率的影响。2)萃取温度对韭菜子油提取率的影响：选取萃取压力25 MPa，分别在35、40、45、50、55、60 ℃萃取2.0 h，考察温度对韭菜子油提取率的影响。3)萃取时间对韭菜子油提取率的影响：在萃取压力25 MPa，萃取温度55 ℃条件下，分别萃取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察萃取时间对韭菜子油提取率的影响。

1.3.3 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取萃取压力、萃取温度、萃取时间作为考察变量，以韭菜子油提取率为响应值，采用三因素三水平响应面分析法进行响应面分析，对韭菜子油萃取工艺进行优化。

1.3.4 甲酯化处理[11]

取韭菜子油0.5 g，置于10 mL具塞试管中，加入正己烷2 mL，0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液1 mL，摇匀，置70 ℃水浴中振摇10 min，冷却，加水至10 mL，振摇提取，离心，取上清液加无水硫酸钠脱水，进样分析。

1.3.5 气相-质谱分析条件

色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度：250 ℃，程序升温：初始温度70 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升温至180 ℃,保持10 min,以1 ℃/min升温至250 ℃,保持10 min；进样量：1 μL，分流进样，分流比20:1；载气为He，载气流速1.0 mL/min。

质谱条件:EI离子源，电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,质量扫描范围50～500 amu。

1.3.6 定性定量分析

采用NIST14.L标准谱库检索和人工谱图解析相结合的手段进行定性，并用气相色谱峰面积归一化法定量计算出各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 韭菜子油超临界CO2萃取工艺的优化

2.1.1 响应面法试验设计

由单因素试验可知，超临界CO2萃取韭菜子油的较优压力范围为20～30 MPa，温度范围为50～60 ℃，提取时间范围在1.5～2.5 h。在此基础上，采用响应面分析法对韭菜子油提取工艺参数进行优化，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面试验设计及结果

2.1.2 回归方程的建立及显著性检验

利用Design Expert 12.0软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到韭菜子油萃取率Y对萃取温度A、萃取压力B、萃取时间C的二次多项回归方程为:Y=40.608 88-0.516 75A-1.251 84B-0.248 287C+0.014 1AB+0.002 533AC-0.000 117BC+0.011 437B2+0.000 532C2。

为了检验回归方程的可靠性并确定各因素对韭菜子油萃取率的影响程度，对回归方程进行了方差分析，结果见表3。

表3 方差分析

由表3可以得知，回归方程模型P值小于0.01，说明回归方程模型高度显著，失拟项P值为0.962 3，不显著，表明回归方程与实际拟合度较好，可用于韭菜子油超临界CO2萃取实验的理论预测。由方差分析结果可知，一次项中影响显著的因素为萃取温度(A) 、萃取压力(B)、萃取时间(C)，且对萃取率的影响大小依次为: 萃取温度(A)>萃取时间(C)>萃取压力(B)。二次项中萃取时间(C)的平方对萃取率的影响显著。3个影响因素之间的互交作用影响不显著。

2.1.3 提取工艺条件的确定及检验

运用Design Expert 12.0设计优化得出最佳萃取条件：萃取温度59.079 ℃、萃取压力28.252 2 MPa、萃取时间147.716 min, 考虑到实际操作的局限性，将萃取条件调整为：萃取温度59 ℃、萃取压力28.3 MPa、萃取时间148 min。在此条件下进行韭菜子油提取的验证实验，3次平行实验结果的平均值为3.91%，与理论预测值基本相符，验证了该模型的准确、可靠，也表明优化的萃取条件切实可行。

2.2 韭菜子油的成分组成

对上述最佳工艺条件下萃取得到的韭菜子油进行GC-MS分析，得总离子流图见图1，利用NIST14.L标准质谱数据库和人工谱图解析相结合的手段，对挥发油成分进行鉴定，并用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，各成分见表4。

图1 韭菜子油总离子流图

由表4可知，共鉴定出16个成分，包含13个脂肪酸化合物、1个脂肪醇类化合物、1个酰卤类化合物和1个萜类化合物。韭菜子油中主要脂肪酸化合物为：亚油酸、油酸、棕榈酸、15-羟基亚油酸、硬脂酸、二十二碳二烯酸、二十酸、二十二酸、11-二十碳烯酸等，其中不饱和脂肪占总脂肪酸的88%。根据文献报道[2,3,9]，韭菜子水提物或者醇提物具有温肾助阳、固精作用。本次研究进一步验证了韭菜子的活性成分是中等极性的化合物，不存在于超临界CO2提取的韭菜子油中。此研究结果对韭菜子油进一步开发成食用保健油具有重要意义。