干热处理辅助酶法制备多孔淀粉及其对淀粉微观结构和理化性质的影响

林思宇 黄赣辉 何深雄

(食品科学与技术国家重点实验室；南昌大学食品学院1，南昌 330047)(江西省瑞昌市疾控中心2，瑞昌 332200)

多孔淀粉是一种新型改性淀粉，由于从表面延伸到淀粉颗粒内部形成了的大量孔隙，导致了淀粉颗粒的中空结构[1, 2]。因其较天然淀粉具有较大的比表面积和吸附能力，可作为吸附载体或吸附剂，扩大了淀粉的应用范围。作为一种无毒、经济的吸附剂已广泛应用于食品、医药、环境等行业[3-5]。在食品工业中，多孔淀粉被用作香料、甜味剂、酶、调味品等的载体，Lei等[6]以多孔淀粉为载体制备了橄榄油微胶囊，提高了橄榄油的保质期和氧化稳定性。Belingheri等[7]研究表明多孔淀粉可用于番茄食品中的风味传递，提高风味物质的稳定性。Zhu等[8]设计了一种基于多孔淀粉和果胶-壳聚糖复合物的结肠靶向药物(阿霉素)递送系统，结果表明所得复合材料在模拟胃和小肠条件下表现出缓释药物的能力。此外，多孔淀粉的吸附也是各种环境技术中的一种替代方法，如污水处理，吸附重金属等。

目前，制备多孔淀粉的方法有化学、物理、生物方法[9-12]。在这些方法中，酶解方法因其高效的催化能力和温和的反应条件而被广泛应用于制备多孔淀粉，且研究表明不同的酶催化效果不同，同时使用α-淀粉酶和糖化酶进行反应制备效果较好[2, 13]。然而，当采用单一方法制备多孔淀粉时，存在一定的局限性，因此，越来越多的研究是结合不同的方法制备性能更好的多孔淀粉[14,15]。由于酶解的方法效率高，酶解与其他处理相协同在多孔淀粉的制备中得到了最广泛的应用[16]。Xie等[17]在酶水解前用重复湿热预处理的方法制备小麦多孔淀粉，结果表明经过重复湿热预处理得到的多孔淀粉吸附能力、比表面积和总孔容积均得到显著提高。吴丽荣等[18]和Majzoobi等[19]研究表明超声可以提高α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶的催化效率，提高多孔淀粉的制备效果。Zhao等[20]联合酶解和冻融处理产生的多孔淀粉的水/油吸附功能得到改善，冻融引起的表面粗糙度增加了颗粒对酶水解的敏感性。

干热改性(Dry heat treatment，DHT)是指是一种物理改性方法，具体是指在60～200 ℃的温度范围内，在含水率小于10%状态下对样品进行热处理[21]。Gou等[22]和Liu等[23]研究表明，DHT在一定程度上能使淀粉特征性质发生变化，如破坏淀粉颗粒表面，改变结晶度和糊化性质等。然而目前关于DHT对淀粉的改性研究多为胶体辅助干热处理对淀粉的影响[24,25]，而结合DHT和酶解制备多孔淀粉的研究较少。本实验旨在将干热处理与酶解结合，以玉米淀粉为原料，采用干热结合酶解的方法制备多孔淀粉，并研究对比了不同改性淀粉的吸附性能、结构特征和理化性质，以期为干热结合酶解制备多孔淀粉的研究和开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉、大豆油；α-淀粉酶(≥10 000U/mL)；糖化酶(≥100 000 U/mL)；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

S3700型扫描电子显微镜，D8 ADVANCE型X射线衍射仪，Autosor-iQ型比表面及空隙度测试仪，Nicolet 5700傅立叶变换红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 改性方法

1.3.1.1 干热处理

研究干热处理时间、温度对淀粉酶解产生多孔淀粉吸附容量的影响，以吸油率为评价指标。将天然淀粉样品放入45 ℃鼓风烘箱中，干燥至淀粉水分含量降到10%以下，再将其于高温下放置数小时，得到干热处理淀粉样品(DHT-starch，DS)。单因素实验采用的固定参数分别为干热温度130 ℃，时间3 h。固定其中一个因素，对另一个因素进行优化，设置干热温度为70、90、110、130、150 ℃，时间为1、2、3、4、5 h。

1.3.1.2 酶解

称取10 g玉米淀粉置于250 mL 锥形瓶中，加入pH为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，按1∶3的配比加入质量分数为2%的α-淀粉酶和糖化酶，将混合溶液放在恒温摇床上进行8 h的酶解反应后，加入一定量的NaOH (2 mol/L)溶液终止反应。将悬浮液在 5 000 r/min条件下离心10 min，用蒸馏水将沉淀物洗涤3次后在50 ℃下干燥，粉碎过100目筛，得到酶解多孔淀粉样品(Porous starch，PS)[2]。

1.3.1.3 结合处理

将制备的干热淀粉进行酶解，得到干热结合酶解制得的多孔淀粉样品(DHT-porous starch，DPS)。

1.3.2 吸附能力的测定

1.3.2.1 对水/油的吸附能力

称取0.5 g多孔淀粉于离心管中，加入5 mL蒸馏水或大豆油后涡旋混合均匀，在室温下将离心管置于振荡器中30 min，然后将混合物以 3 000 r/min 离心 5 min 后除去上清液，直到没有多余的水或油滴到滤纸上后测量沉淀物的质量[13]。并按式(1)计算吸水率/吸油率：

(1)

式中：W0为干基淀粉质量/g；W为离心后混合物的质量/g。

1.3.2.2 对亚甲基蓝的吸附能力

将0.5 g淀粉样品加入含50 mL亚甲基蓝(20 mg/L)水溶液的离心管中，恒温振荡器中震荡2 h后，将混合物在4 000 r/min下离心10 min，用分光光度计测定上清液在665 nm处的吸光值[26]。并按式(2)计算平衡吸附容量：

(2)

式中：Qe为吸附容量/mg/g；V为吸附溶液的体积/mL；C0为MB溶液的初始/mg/L；Ce为MB溶液的平衡浓度/mg/L；m为淀粉样品的质量/g。

1.3.3 淀粉颗粒形态观察

取少量淀粉样品均匀分布于双面胶上并在真空环境下进行喷金处理，使用扫描电镜在10 kV电子束条件下对淀粉进行观察成像，观察淀粉颗粒微观形貌和表面结构[13]。

1.3.4 FT-IR分析

将干燥淀粉样品与溴化钾粉末混合压片，进行红外扫描，扫描波数范围在400～4 000 cm-1[2]。

1.3.5 淀粉晶体结构的测定

采用X-射线衍射仪对淀粉晶体结构进行分析。测定条件：电压40 kV，电流30 mA，辐射源为CuKα，波长0.54 nm，扫描范围5°～35°(2θ)，收集衍射图。样品的相对结晶度(RC)通过JADE 5.0 系统计算[27]，以百分比表示。

1.3.6 比表面积及孔径的测定

测定了液氮温度-195.8 ℃(77.35 K)下氮气吸附-解吸等温线，分别用多点BET(Brunner-Emmet-Teller)和BJH(Barret-Joyner-Halenda)法计算淀粉样品的比表面积和孔径及孔径分布。测定前，淀粉样品需在100 ℃真空下干燥24 h[28]。

1.3.7 热特性测定

采用热重分析仪测定了不同淀粉的热特性，取10 mg左右样品，在氮气中以10 ℃/min的加热速率从30 ℃加热到800 ℃[6]。

1.3.8 数据处理与分析

采用SPSS24.0 对实验数据进行差异性分析(ANOVA)，P<0.05表示差异显著。采用Origin、Excel软件作图。每个实验均做3 次平行，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

图1为干热时间和干热温度对制得多孔淀粉吸油率的影响。随着温度的升高，吸油率先升高后减小。干热温度为70 ℃时干热处理对吸油率无明显影响，可能是由于在低于淀粉糊化温度时，干热处理对淀粉的影响较小。DHT温度为130 ℃时吸油率达到最高，150 ℃时下降，温度的升高使淀粉双螺旋结构开始解旋，颗粒变得疏松，淀粉酶解效率提高，吸油率增大。温度过高时，淀粉颗粒过于疏松容易导致崩塌，从而吸油率下降[29]。随着DHT时间的增加，DHT使得淀粉表面出现破损，多孔淀粉的吸油率先上升后下降，干热时间为3 h时达到最高值，可能是由于时间过长导致淀粉损伤过大，酶解时淀粉过度水解，淀粉颗粒破碎，导致吸附能力降低。

图1 DHT条件对吸油率的影响

2.2 扫描电镜分析(SEM)

由图2可知，天然淀粉表面光滑，多呈卵形、不规则多边形等。经DHT处理后的淀粉颗粒(图2B和图2b)表面有破损，出现裂痕，变得粗糙，且部分淀粉颗粒表面出现凹坑，可见DHT对淀粉颗粒产生了破损作用，但淀粉颗粒形态仍保持完整，这与Liu等对马铃薯淀粉进行干热处理后的现象一致[23]。PS淀粉表面出现孔洞，酶解反应能显著改变淀粉的颗粒形态，结果与Zhang等[2]和Dura等[30]报道一致[2,30]。DPS表面也出现孔洞，且孔洞数量较PS多。可能是因为DHT破坏了淀粉的表面结构，增加了酶的接触位点，增大了酶解效率，导致结合处理淀粉表面产生了数量更多的孔洞[17]。SEM结果表明DHT使得淀粉形态结构发生了变化，这些变化对淀粉的酶解反应有促进作用，使得淀粉颗粒形成的孔洞数量更多。

注：A、B、C、D分别为天然淀粉(NS)、干热处理淀粉(DS)、酶解多孔淀粉(PS)、干热-酶解多孔淀粉(DPS)，放大×1 000倍，a、b、c、d 为对应淀粉放大×5 000倍。图2 不同淀粉的扫描电镜图

2.3 干热处理对吸附能力的影响

表1显示了不同淀粉的吸附能力，天然淀粉经过不同处理后，吸附能力均有所改变。经干热处理后淀粉吸附能力略高于天然淀粉，可能是干热处理使淀粉表面出现的裂痕和凹坑导致了吸附能力的增强。且结合改性得到的DPS吸附能力最高，其次是单一酶解PS。其中DPS的吸水率、吸油率较PS有显著提高。亚甲基蓝的吸附能力从3.39 mg/g增加至6.10 mg/g，多孔淀粉的吸附过程为物理吸附[26]，表面孔洞大小及数量可以影响其吸附性能，与酶解淀粉相比，结合改性制备得到的淀粉吸附能力显著增大，可能由于DHT使得淀粉表面产生了凹痕促进了酶与淀粉的接触，或干热过程中高温使得淀粉部分双螺旋结构开始解旋，淀粉颗粒结构变得疏松[29]，使得酶解反应更容易进行，从而促进表面孔洞的产生，吸附能力增强。

表1 不同淀粉的吸附性能

2.4 FT-IR分析结果

由图3可见，不同改性的淀粉特征吸收峰的位置没有变化，这表明干热处理和酶解均未改变淀粉的基本化学结构，所以改性后淀粉的官能团与天然淀粉相似。3 400 cm-1附近的峰和-OH基团有关，2 929 cm-1处的峰与-CH2的伸缩振动有关，该处峰值强度的增加表明材料的亲脂性也相应增加[31]。从图可见PS在3 400、2 929 cm-1处峰值强度均大于天然淀粉，表明孔洞的产生使得淀粉亲水基团和亲脂基团均暴露更多。且DPS在这两处的峰值强度大于PS，说明DHT和酶解结合制备的多孔淀粉显露出更多的亲水和亲脂基团，吸水性和吸油性增强可能与此有关。

图3 不同淀粉的FT-IR图谱

在1 047、1 022 cm-1处的红外吸收分别与淀粉的结晶区和无定形区有关，995 cm-1处的吸收与C-6处羟基的分子内氢键有关，其中(1 047/1 022) cm-1峰强度比值越大，表明颗粒内有序度越高，而(1 022/995) cm-1峰强比值越小，颗粒内有序度越高[32]。由表2可见，酶解后淀粉(1 047/1 022) cm-1比值下降，(1 022/995)cm-1增大，表明酶对淀粉颗粒的无定形结构更为敏感，酶解反应优先在淀粉的无定形区进行。而DPS的(1 045/1 022) cm-1和(1 022/995) cm-1分别为1.176和0.899，表明DPS的有序度较PS更高，可能与DHT促进酶解反应导致淀粉颗粒更多的无定形区被酶解有关。

表2 不同淀粉的晶体特征

2.5 淀粉的结晶性质

由图4可知，四种淀粉均在15°、17°、18°、20°和23°(2θ)有较强的峰，这是A型淀粉结晶结构的图谱[33]，表明DHT和酶解均不会改变淀粉的晶型。淀粉衍射峰强度和相对结晶度能反应淀粉的晶体性质，仅经DHT后的淀粉较天然淀粉的衍射峰强度无明显变化，而多孔淀粉PS和DPS相对于天然淀粉衍射峰的强度明显增强。DS的相对结晶度为19.67%，较天然淀粉变小，可能是由于DHT使得淀粉结晶区受损以及双螺旋结构的弱化，一定程度上破坏了淀粉的有序结构，淀粉的相对结晶度降低。经过酶解后，淀粉的相对结晶度增大至21.06%，这可能是由于酶解优先在淀粉的无定形区进行，酶解反应使淀粉无定形区比例下降，从而使结晶区比例增加[13]。DPS的相对结晶度为21.22%，略高于PS，且这与FTIR的结果一致，可能是由于DHT使得酶促反应在更多的无定形区发生。

图4 不同淀粉的X-衍射图谱

2.6 比表面积和孔径分布

由图5可知，两种多孔淀粉的孔洞多为<20 nm的中孔，一般孔隙分为直径小于2 nm的微孔、直径在2～50 nm之间的中孔和直径大于50 nm的大孔[34]。且DHT结合酶解得到的多孔淀粉的总孔容积显著大于仅经酶解制得的多孔淀粉，表明结合改性使淀粉产生了更多的中孔，导致总孔容积增大。由表3可知，DPS的比表面积大于PS的比表面积，PS和DPS的总孔容积分别为21.22×10-3、31.41×10-3cm3/g，而两种多孔淀粉的平均孔径大小并无明显区别，这表明DHT使得多孔淀粉表面生成了更多的孔洞，是由于孔隙数量变多而不是使孔径变大提高吸附能力。这与SEM的结果一致，DPS表面形成的孔隙比PS表面更多。

图5 不同淀粉孔径分布图

表3 不同淀粉比表面积及孔径分布

2.7 不同淀粉的热特性

由图6可知，4种淀粉均存在两个热失重过程，第一阶段发生在100 ℃左右，由淀粉分子内结合水的蒸发引起。第二阶段在160～380 ℃之间，这部分失重是因为淀粉在这个阶段开始分解[35]。多孔淀粉的热分解起始温度明显低于未形成孔洞的淀粉，可能是由于孔洞的形成使得淀粉的结构变疏松，导致淀粉耐热性变差。经DHT的淀粉和天然淀粉的热分解起始温度相似，但DHT淀粉最大分解速率对应的温度大于天然淀粉，说明DHT使淀粉热稳定性稍有提高。而DPS的开始分解温度较PS高，最大分解速率对应的温度明显高于PS，且DPS的热分解残余率也大于PS，表明DPS的耐热性能较PS更好，可能是由于DHT提高了多孔淀粉的致密性。

图6 不同淀粉的TG-DTG图

3 结论

淀粉经过DHT后，颗粒表面出现破损和凹坑，有利于酶解反应的进行，从而提高了淀粉的酶解效率，与单一酶解制得的多孔淀粉相比，DHT结合酶解使得淀粉表面产生了更多数量的孔洞，比表面积和总孔容积显著增大，淀粉的吸附能力增强。XRD和FT-IR的结果表明所有淀粉样品的X射线衍射图和红外光谱相似，DHT和酶解均没有使淀粉产生新的基团，也未改变淀粉的晶型，但孔洞的产生破坏了淀粉颗粒的结构，且DHT多孔淀粉具有更高的相对结晶度。此外，热重分析中DHT多孔淀粉还表现出更好的耐热性。本研究结果表明，DHT能有效改善多孔淀粉的性能，制得的多孔淀粉无毒且具有良好的生物相容性，DHT结合酶解制备的多孔淀粉可作为吸附载体应用于食品领域。