基于IL-6/STAT3信号通路观察姜黄素对炎症相关性结直肠癌的影响

邱敏霞 孔灿灿 陈文妹 赵心恺 （海南省人民医院内镜诊疗中心，海口570311）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）作为一种特发性肠道炎症性疾病，累及回肠、直肠和结肠，以腹痛、腹泻为主要临床表现，严重者会出现血便。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的主要类型，我国UC 的发病率呈逐年上升的趋势［1］。UC 的机制尚不清楚，目前认为主要与环境、遗传、感染及免疫有关，其中肠黏膜免疫系统异常在UC 发病中发挥重要作用［2］。大量研究提示UC是结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发生的危险因素，因其发病机制与散发型CRC 有所不同，故这种由结肠炎症演变的CRC 又称为炎症相关结直肠癌（colitis-associated CRC，CAC）［3］。多种白细胞介素介导的炎症反应参与UC 的癌变过程，有报道称，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcrip⁃tion 3，STAT3）通路在细胞生理活动中发挥重要作用，且已被证实与癌症有关［4］。研究发现，CAC 患者血清及癌组织中IL-6 水平明显升高，进一步分析发现与肿瘤转移及预后生存率明显相关［5］。STAT3 作为IL-6 信号通路下游关键调节因子，在CAC 大鼠中持续激活，甚至有学者认为STAT3属于致癌基因［6］。姜黄素（curcumin，CUR）是从姜黄根茎中提取的多酚类物质，近年来研究发现，CUR 可以调节多个信号通路，具有广泛的药理作用［7］。研究表明，CUR 影响肠上皮癌细胞的增殖、分化、凋亡，此外还可调节胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等多种癌症相关的信号通路［8］。本研究旨在从IL-6/STAT3信号通路揭示CUR对CAC的干预作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SYXK（京）2017-0033），体重为（20±2）g，饲养于本院动物实验中心，饲养室保持良好通风，饲养温度为（25±2）℃，湿度（50±10）%，12 h 循环光照。正常饲养1 周以适应环境，第2周开始进行实验，所有动物均在本实验室SPF 级动物房饲养，动物的使用及操作按照本院动物管理委员会（IACUC2018-012）的规定执行，并在不影响实验要求和结果基础上，按照3R 原则给予人道主义关怀。

1.1.2 药品与主要试剂 CUR（批号：938900296）购自南京泽郎生物医药有限公司；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（批号：17029838）、反转录试剂盒（批号：52-0394）购自美国Sigma公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）（批号：01837473）购自美国 MP Bio 公司；TNF-α（批号：18203094）、IL-1β（批号：18162994）、IL-4（批号：18209388）和IL-10（批号：18129012）ELISA 试剂盒购自上海酶联生物公司；Trizol 试剂盒（批号：JZ298312）购自日本TaKaRa 公司；全蛋白抽提试剂盒（批号：W2130934）购自德国QIAGEN 公司；Western blot 试剂盒（批号：838773321）购自美国 BD 公司；IL-6（批号：ER37-466612）、STAT3（批号：AM3778934）、p-STAT3 抗体（批号：SA3818934）购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组 按照参考文献的方法构建模型［9］，取 33 只雄性昆明大鼠自由饮用2%DSS水溶液共7 d；之后普通饮用水14 d。随机选取3 只大鼠取结肠组织进行病理学检查，按照YAS⁃SIN 等［10］的方法证实模型构建成功，将剩下的 30 只大鼠随机分为模型（Model）组、CUR 低剂量（Low dose）组和CUR 高剂量（High dose）组，另取10 只大鼠21 d 始终给予普通饮用水作为对照（Control）组。CUR 低剂量组、CUR 高剂量组自造模第1 天开始分别灌胃给予15 mg/kg、30 mg/kg 的CUR（溶于花生油），灌胃剂量2 ml，连续给药7 d，以该7 d 作为1 个循环，共进行4 个循环。对照组和模型组给予等体积花生油灌胃处理。分别将第7、14、21、28 天计为1 个循环最后1 d 称重。实验结束2 d 后大鼠断颈处死。取出结肠组织，判断观察成瘤数量，用游标卡尺测定肿瘤平均直径，计算瘤负荷（即所有肿瘤的平均直径之和），以直径D≥1 mm 作为成瘤标准。生理盐水冲洗后一半放于4%多聚甲醛溶液固定，另一半存储于-80℃冰箱备用。

1.2.2 HE 染色检测大鼠结肠组织形态 结直肠组织在多聚甲醛中浸泡48 h 后，经脱水、常规石蜡包埋，切成4 μm的切片。然后依次脱蜡、水化，进行HE 染色、脱水、二甲苯充分浸泡2 h 直至透明后干燥。用中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态并拍摄。

1.2.3 ELISA 检测大鼠结直肠组织匀浆液上清中炎症因子含量 取各组大鼠结直肠组织制成匀浆，4 000/rmin 离心15 min，取上清液为待测样本。ELISA 试剂盒测定 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 的含量，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。反应终止后，采用酶标仪测量450 nm 处的OD值。

1.2.4 免疫组化检测大鼠结直肠组织上皮钙黏素（epithelia calcium，E-cadherin）和 Vimentin 的表达 组织切片常规脱蜡和水化后置于PBS缓冲液中高压修复，然后用3%双氧水室温下浸泡以阻断内源性过氧化物酶，封闭，分别加稀释好的一抗4℃过夜孵育，次日复温后PBS洗涤干净，分别加稀释好的二抗，室温孵育30 min，PBS 洗涤。加适量DAB 孵育5 min，去离子水终止反应，苏木素复染5 mim，无菌水冲洗后，依次用不同浓度梯度乙醇脱水2 h，无菌滤纸吸净表面残存液体，二甲苯透明，用中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态并拍摄。参照文献方法进行评估，每张切片随机选取5 个高倍镜视野（×200）在光镜下连续观察10个视野，每个视野内计数200个细胞中阳性细胞数，染色强度计分依据：按照无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色顺序分别计0 分、1 分、2 分、3 分。阳性细胞数计分：按照无阳性细胞、阳性细胞<25%、阳性细胞26%～50%、阳性细胞51%～75%、阳性细胞>75%分别记0分、1分、2分、3分以及4分。以上两项计分相加后作为评判结果，最低0分，最高7分。

1.2.5 RT-qPCR 检测大鼠结直肠组织mRNA 的表达 依据Trizol 法提取各组样本的总RNA，使用引物如下：H19（上游：5'-ACCTGGAGCAAGCCATTAGCC-3'，下游：5'-CGGACCGCATTCAAGTCATAGT-3'）；let-7a（上 游 ：5'-GCAACCATTAGCCGCCATTAG-3'，下游：5'-CAAGTCATCGGACCGCATTAGT-3'）；c-Myc⁃mRNA（上游：5'-AAGCCATAAGCCGAGCTTCAAGCC-3'，下游：5'-CGGACCGCAGTCATATAACCTG⁃GT-3'）；高迁移率族蛋白A2（high mobility group pro⁃teinA2，HMGA2 mRNA）（上游：5'-ACATTAGCCG⁃GACTGCCGCAA-3'，下游：5'-ACATCGGTCAGTCAACGCTAGT-3'）。反应条件：75℃ 预变性 2 min，进入以下循环90℃变性5 min；60℃退火60 s；72℃延伸 30 s；共 40 个循环。相对表达量用 2-ΔΔCt表示。每个样本独立重复实验3次。

1.2.6 Western blot 检测大鼠结直肠组织IL-6/STAT3 通路蛋白表达 分别收集各组样本，用总蛋白提取试剂盒提取组织匀浆中总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。制备蛋白样品并进行SDS-PAGE 凝胶电泳，然后转至PVDF 膜，加含有5%BSA 的封闭液室温下封闭2 h。加入适宜浓度一抗于4℃封闭过夜。次日用缓冲液清洗PVDF膜3次，加入二抗，室温孵育1 h后，加入显色液曝光显影。

1.3 统计学分析 数据统计采用SPSS19.0 软件，作图工具采用Graphpad 5.01，两组间比较采用t检验，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 CUR 对体重的影响 造模期间，Model 组大鼠先后出现精神萎靡、活动量减少、毛泽无光、进食减少等现象，个别出现便血；给予CUR 治疗的大鼠活动量及饮食量增加，便血症状消失。与Control 组相比，Model 组大鼠在第7 天起至第21 天体重增加明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与Model组相比 Low、High dose 组大鼠第 7 天起至第 21 天体重升高明显，High dose 组大鼠体重升高更加明显，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。

图1 CUR对CAC大鼠体重的影响Fig.1 Influence of CUR on weight of CAC rats

2.2 CUR 对大鼠结直肠组织形态的影响 观察大鼠结肠组织外观，如图2，Control 组外观正常，黏膜完整光滑，未见组织增生；Model 组结肠组织出现肉眼可见的组织增生，且有肿瘤产生（P<0.05）；与Model组相比，Low dose组结肠组织增生和肿瘤明显减少，High dose 组肿瘤减少更为明显（P<0.01）。镜下观察各组大鼠结肠组织HE 染色病理切片，Con⁃trol 组大鼠结肠组织黏膜完整，腺体结构整齐，黏膜下未见炎症；Model 组部分结肠明显充血，大部分结肠黏膜内细胞排列紊乱，炎症细胞浸润组织，代替正常细胞，肠腺出现溃疡，失去结肠腺体及肌层的正常结构；与Model 组相比，Low dose 组炎症浸润减少，黏膜层和肌层损伤减轻，High dose 组炎症浸润明显减少，腺体结构较为完整。

图2 CUR对大鼠结直肠组织形态的影响Fig.2 Influence of CUR on colorectal tissue morphology in rats

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10在大鼠组织匀浆液上清中的表达变化 与Control 组相比，Model 组TNF-α、IL-1β 表达水平升高，IL-4、IL-10 表达水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与Model组相比，Low dose、High dose 组 TNF-α、IL-1β 表达水平均有不同程度下降，IL-4、IL-10 表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），且High dose组变化更明显（P<0.01），见图3。

图3 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 在大鼠组织匀浆液上清中的表达变化Fig.3 Expression of TNF-α，IL-1β，IL-4 and IL-10 in rat tissue homogenate supernatant

2.4 RT-qPCR 检测 H19、let-7a、c-Myc mRNA、HM⁃GA2 mRNA 的表达 与 Control 组相比，Model 组中H19、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 表达明显上升，let-7a 表达明显下降，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与 Model 组相比，Low dose、High dose 组中H19、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 表达明显下降，let-7a 表达明显升高（P<0.05），且High dose 组变化更明显，差异均具有统计学意义（P<0.01），见图4。

图4 H19、let-7a、c-Myc mRNA、HMGA2 mRNA 大鼠组织匀浆液上清中的表达变化Fig.4 Expression changes of H19，let-7a，c-Myc mRNA，HMGA2 mRNA in rat tissue homogenate superna⁃tant

2.5 免疫组化检测E-cadherin、Vimentin 在大鼠结肠组织中的表达变化 见图5，与Control 组相比，Model 组中E-cadherin 蛋白表达评分明显降低，Vi⁃mentin 蛋白表达评分明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与 Model 组相比，Low dose、High dose 组E-cadherin 蛋白表达评分明显升高，Vimentin 蛋白表达评分明显下降（P<0.05），且High dose组下降水平更明显，差异有统计学意义（P<0.01）。

图5 E-cadherin、Vimentin在大鼠结肠组织中的表达变化Fig.5 Expression changes of E-cadherin and Vimentin in colon tissues of rats

2.6 IL-6/STAT3 通路蛋白在大鼠结肠组织中的表达变化 与Control 组相比，Model 组中IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；与 Model 组相比，Low dose、High dose组IL-6 和p-STAT3 蛋白表达水平均下降（P<0.05），且High dose 组下降水平更显著，差异具有统计学意义（P<0.01），各组大鼠结肠组织中STAT3 蛋白差异无统计学意义（P>0.05），见图6。

图6 IL-6、STAT3、p-STAT3 蛋白在大鼠结肠组织中的表达变化Fig.6 Expression changes of IL-6，STAT3 and p-STAT3 proteins in colon tissues of rats

3 讨论

CRC 是世界范围内发病率位居第三的恶性肿瘤，仅次于肺癌和乳腺癌，UC 患者是CRC 的高发人群，随着病程的延长，癌变风险明显增加。尽管CAC 只占CRC 病例的2%，但在CRC 死亡患者中占20%左右［11］。CAC 的发病是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程。以往流行病学数据和临床研究表明，补充 CUR 或者升高血清 25（OH）D 水平对于CAC 具有一定的预防作用［12］。研究发现［13］，CUR 可以有效降低结肠炎症小鼠的炎症水平并对CAC 形成保护作用，但其作用机制尚未阐明。因此本研究探讨CUR 对CAC 的疗效及其相关的分子机制。本研究首先成功构建大鼠CAC 模型，并于一段时间后给予CUR 治疗，发现与未获得治疗的大鼠相比，CUR 治疗后的大鼠精神状态、活动、饮食等情况均明显好转，观察期内体重在治疗后也逐步增长。取大鼠结肠组织，发现与模型组相比，CUR 各组大鼠结肠肿瘤数量均明显减少；HE 染色切片观察炎症浸润明显减少，病变减轻，且CUR 高剂量组更加明显，证明CUR对CAC大鼠具有较好的保护作用。

在肿瘤发生、发展的各个阶段伴随的慢性炎症均会产生细胞因子的释放［14］。IL-6/STAT3 是细胞内介导炎症信号转导的重要通路，其可介导促炎细胞因子TNF-α、IL-1β 和抑炎细胞因子 IL-4、IL-10 等多种炎症因子的产生，而炎症因子之间的平衡失调会导致肿瘤的发生［15］。研究显示，TNF-α 是重要的炎症递质，介导局部炎症反应并可导致器官或多系统受损［16-17］。IL-1β 具有较强的促炎活性，在促进多种炎症细胞向肠黏膜趋化浸润中发挥重要作用，是肠黏膜上皮的损害的重要因素［18］。IL-4 和 IL-10 在炎症疾病中均为有效的抗炎物质，能够保护机体出现过度病理反应。有研究表明，IL-4和IL-10能够通过下调炎症介质TNF-α和IL-6的表达促进机体体液免疫反应，并且IL-4、IL-10 可在直肠炎中共同作用逆转Th1/Th2 细胞活化过程，进而改善黏膜修复［19］。本研究发现给予 CUR 治疗后，TNF-α、IL-1β表达水平均有不同程度的下降，高剂量组下降更为显著，而抑炎因子IL-4、IL-10 的表达水平明显升高。该研究结果提示 TNF-α、IL-1β、IL-4 和 IL-10 参与CAC 的发病与免疫过程，而CUR 能够较好地调节TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的表达，从而发挥对CAC的治疗作用。

IL-6 的高表达可以促进STAT3 持续磷酸化，激活后的p-STAT3具有较强抑制细胞凋亡并促进细胞增殖的作用［20］。研究发现，p-STAT3 可转位至细胞核发挥对靶基因的调控作用，其中c-Myc是p-STAT3的靶基因之一，也是一个重要的原癌基因，参与了细胞周期的调控作用，c-Myc 的高表达可导致细胞增殖，最终诱发癌变［21］。c-Myc 可作为转录因子与H19启动子结合，调控H19的表达，而H19被证明可通过多种作用调控肿瘤细胞的增殖，在CRC 细胞中，H19 可下调微小 RNA let-7a 的表达，let-7a 在哺乳动物中可以调节细胞周期而参与细胞增殖的调控作用［22］。有研究发现，let-7a 过表达后，结肠癌细胞增殖明显受到抑制，提示了let-7a 对结直肠癌肿瘤具有抑制作用［23］。本研究中，模型组大鼠c-Myc和H19表达水平明显升高，let-7明显降低，提示CAC大鼠的发病与三种基因的表达有关。另有报道称，let-7a 下调后对下游靶蛋白HMGA2 抑制作用减弱明显，而HMGA2是介导EMT的重要环节，EMT是指上皮细胞转化为间质细胞的生物学行为，在胚胎形成、器官发育、组织再生和肿瘤转移过程中起到重要的作用［24］。在肿瘤进展中，分别代表上皮细胞和间质细胞的标记物E-cadherin 和Vimentin 的异常表达可以反映出肿瘤细胞的侵袭能力、药物敏感性和抗凋亡能力的变化，且已有研究证实，EMT 促进CAC 的发生、发展和转移［25］。除上述推测的 EMT 机制外，多种参与炎症的细胞因子在EMT 介导的CAC中亦发挥着关键作用［26］。本研究中，模型组大鼠IL-6、p-STAT3 蛋白，HMGA2 mRNA 及 Vimentin 蛋白表达评分明显升高，E-cadherin 蛋白表达评分明显下降，而经 CUR 治疗后 IL-6、p-STAT3 蛋白，HMGA2 mRNA 及Vimentin 蛋白表达评分明显降低，E-cad⁃herin 蛋白表达评分明显升高，且高剂量组变化更明显。说明CUR 可能通过IL-6/STAT3 信号通路调控EMT机制发挥对CAC大鼠的保护作用。

综上所述，CUR 对大鼠CAC 形成具有保护作用，其机制可能与IL-6/STAT3 信号通路的调控，降低炎症反应及抑制EMT的发生有关。