泽泻汤加味方对盐敏感性高血压Dahl大鼠肾脏NADPH氧化酶表达的影响❋

张婷婷， 吴鑫宇， 陆雪健， 滕 尧， 张树峰， 蒋希成△

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040； 2.宁波大榭开发区医院， 浙江 宁波 315800；3.承德医学院， 河北 承德 067000)

《黄帝内经》中有“咸者，脉弦也”和“咸伤肾”的记载，对盐与血压及肾脏的关系有所阐述。《中国高血压防治指南(第三版)》提出食盐摄入量与高血压发生密切相关，高血压中盐敏感性高血压 (salt-sensitive hypertension，SSH)占60%[1]。SSH是由高盐摄入引起的血压升高，其发生与生理、环境、人口和遗传因素有关，肾的水钠代谢障碍与内皮功能障碍被认为是SSH发生的主要机制[2]。

现代研究表明，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH氧化酶)是血管紧张素II(AngiotensinII, AngII)对血压和血管炎症反应的关键决定因素。NOX4是NADPH氧化酶主要在肾脏表达的亚型，p22phox、p47phox是NADPH氧化酶的亚基。实验研究表明，调控NADPH氧化酶亚基的表达对调控血压及肾保护具有重要意义。本实验通过高盐饮食诱导SSH动物模型，研究泽泻汤加味方对肾脏NOX4、p22phox和p47phox表达的影响，分析其对血压的调控与肾脏的保护机制。本研究已通过黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会审查，伦理学批准号2016050601。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性4周龄Dahl大鼠60只，体质量80～100 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SCXK(津)2012-0001。饲养于黑龙江中医药大学药物安全评价中心，环境温度(20±2)℃，相对湿度(40～42)%，各组大鼠自由觅食饮水，规律光照。

1.2 饲料及造模

8%NaCl高盐纯化饲料(批号16030601(A2)，购自开源动物饲料(常州)有限公司；正常饲料(SPF级)购自北京科奥协力饲料有限公司)。除空白对照组给予正常饲料外，其余5组均给予8 %NaCl高盐纯化饲料，喂养4周后造模。经过4周造模成功给予正常饲料。

1.3 药物

泽泻汤加味方组成：泽泻21 g，麸炒白术9 g，泽兰15 g，石菖蒲15 g，购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药饮片局。

1.4 分组及给药

60只Dahl大鼠随机分为空白对照组、模型组、缬沙坦组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组6组各10只。泽泻汤加味方前期研究选用L9(34)正交表，得出组方最佳配比[3]，浓缩制成浓度为1∶1水煎剂，根据人与大鼠给药剂量比例进行等效转换，中药低剂量组5.4 g·kg-1·d-1灌胃，中药中剂量组10.8 g·kg-1·d-1灌胃，中药高剂量组21.6 g·kg-1·d-1灌胃，缬沙坦组给予缬沙坦7.2 mg·kg-1·d-1灌胃，空白对照组及模型组给予等体积5% CMC-Na溶液灌胃，每日1次连续给药4周。

1.5 主要试剂与仪器

缬沙坦(批号H20040217)，北京诺华制药有限公司；phox-p22抗体(bs-3879)，美国Bioss公司；phox-p47抗体(bs-6966)，美国Bioss公司；NOX4抗体(14347-1)，武汉三鹰生物技术有限公司；NC膜，美国 Millipore公司；PBS磷酸盐缓冲，北京博奥拓科技有限公司；二甲苯，天津永大化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、戊二醛、水合苏木素、无水乙醇、95 %乙醇，天津市福晨化学试剂厂。

BP-6动物无创血压测试仪、BP-420F通用4通道生物机能系统(成都泰盟科技有限公司)；2135型组织切片机、EMUC7超薄切片机(德国Leica公司)；TECNAI G2透射电镜(美国FEI公司)；ABI7500荧光定量PCR仪、Multiskan MK3酶标仪、Nano Drop 2000分光光度计 (美国Thermo公司)；电泳仪、半干槽(美国Bio-Rad公司)；Tanon 1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；Mini P-4电泳槽、湿转电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司)；水平脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)等。

1.6 体质量及血压测量

造模成功后，各组大鼠于给药前和给药1、2、3、4周末各测定1次体质量和血压。采用无创尾套法测定清醒大鼠尾部收缩压(SBP)，每次灌药后2 h开始测量SBP，记录3次并取平均值。

1.7 肾脏标本采集及固定

10 %水合氯醛腹腔内给药麻醉，取大鼠双侧肾脏称重，计算肾重/体质量指数，用刀片自肾门处冠状切面对半剖开，一部分放入95 %乙醇中，过碘酸-雪夫氏(PAS)染色，中性树胶封固，每组选取4个标本(× 400)，光镜下观察肾脏病理组织形态改变。另取部分肾组织置于3 %戊二醛中，乙醇脱水丙酮包埋，每组选取4个标本(×20000)，在透射电镜下观察肾脏病理组织超微结构变化。其余肾组织剖开后装入5 mL冻存管，立即放入液氮冻存，用于蛋白及mRNA检测备用。

1.8 Western blot 检测p22phox、p47phox和NOX4蛋白表达

将肾组织剪碎进行总蛋白提取，预冷RIPA蛋白抽提试剂加入蛋白酶抑制剂。细胞计数，以细胞数量1×107加入1 ml裂解液，冰上孵育20 min，4 ℃ 13000 rpm离心20 min，取上清分装保存待测。进行核蛋白提取，充分混匀后冰上放置40 min，1 4000 rpm4 ℃离心15 min，上清即为胞核蛋白。应用 BCA法蛋白定量酶标仪读取OD值。以RIPA调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液后样品终浓度煮沸变性5 min。根据目的蛋白p22phox、p47phox和NOX4的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5 %，10 μg每孔上样，通过预染蛋白Marker 确定电泳停止时间，然后进行转膜和染色并观察转膜效果。用3 % BSA-TBST稀释p22phox、p47phox和NOX4蛋白，浓度为1∶500，内参蛋白GAPDH浓度为1∶2000，室温孵育10 min，4 ℃过夜封闭。第2天膜处理后曝光，显影2 min定影，拍照保存图像，分析软件测定条带光密度值，以光密度值代表蛋白的相对表达量。

1.9 RT-PCR检测p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表达

采用Trizol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，把组织放入已预冷的研钵中进行研磨处理备用。用紫外吸收测定法检测浓度和纯度，变性琼脂糖凝胶电泳制胶，准备RNA样品进行电泳，进行紫外透射光下观察并拍照，对RNA质量进行检测。表1示，设计p22phox、p47phox和NOX4 mRNA引物，采用 GAPDH 作内参。实验操作严格按产品说明书进行扩增，逆转录合成cDNA，60～95 ℃进行融解曲线分析，仪器自动绘制出对应的内参基因和目的基因标准曲线。将所有的cDNA样品分别配置RT-PCR反应体系，混合溶液5000 rpm短暂离心，加样后进行PCR反应。各样品的目的基因和内参分别进行反应，每个样本检测3个复孔，数据采用2-△△ CT法进行分析。

表1 RT-PCR各基因引物序列

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 各组不同时间SBP

表2示，与空白对照组比较，模型组给药前和给药1、2、3、4周后SBP升高(P<0.05)，提示造模成功；与模型组比较，缬沙坦组给药2、3、4周后SBP降低 (P<0.05)，中药高、中、低剂量组给药3、4周后SBP降低(P<0.05)。

表2 各组Dahl大鼠不同时间SBP变化比较

2.2 各组大鼠体质量、肾重、肾重/体质量

表3示，与空白对照组比较，模型组肾重、肾重/体质量升高 (P<0.05)；与模型组比较，中药中剂量组肾重、肾重/体质量降低(P<0.05)，各组间体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组Dahl大鼠干预4周体质量、肾重、肾重/体质量变化比较

2.3 肾脏病理组织学变化

2.3.1 PAS染色观察肾脏病理组织形态 PAS染色下缬沙坦组及中药高、中、低剂量组肾脏病理组织改变较模型组轻，以中药中剂量组明显。图1示，空白对照组肾小球大小和结构基本正常，未见明显深染区域呈弱染色。模型组大鼠肾小球体积明显增大且呈分叶状，系膜细胞增生，PAS阳性物质增多深染，间质增生。与模型组比较，缬沙坦组和各中药组肾小球体积减小，PAS阳性物质减少，基底膜增厚减轻。

注：a.空白对照组；b.模型组；c.缬沙坦组；d.中药低剂量组；e.中药中剂量组；f.中药高剂量组

2.3.2 透射电镜观察肾脏病理组织超微结构变化 透射电镜下，缬沙坦组及各中药组肾脏病理组织超微结构改变较模型组轻，肾小球、肾小管结构完整度好于模型组。图2示，空白对照组肾小球可见毛细血管内皮细胞呈扁平梭形，粗面内质网、线粒体等结构完整，基底膜连续完整，结构清晰完整，足细胞未见异常；肾小管上皮细胞未见肿胀，细胞器结构完整。模型组肾小球基底膜结构界限不清晰并有破坏，膜肿胀不均，增厚变硬明显增生，线粒结构破坏，可见足细胞融合；肾小管细胞核内染色质边集，胞内溶酶体增多变性，线粒体亦出现肿胀及嵴结构消失呈空泡变性。缬沙坦组及各中药组可见肾小球少量基底膜呈节段性增厚，但膜结构连续足突基本正常，系膜细胞及基质未见明显增生，细胞内细胞器结构好于模型组，线粒体肿胀但嵴结构存在；部分肾小管可见胞质内溶酶体增多，其余部分未见明显异常。

注：a.空白对照组；b.模型组；c.缬沙坦组；d.中药低剂量组；e.中药中剂量组；f.中药高剂量组

2.4 泽泻汤加味方对p22phox、p47phox和NOX4蛋白表达的影响

图3表4示，与空白对照组比较，模型组p22phox、p47phox和NOX4蛋白表达升高 (P<0.05)；与模型组比较，缬沙坦组及各中药组p22phox、p47phox和NOX4蛋白表达降低，中药中剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组Dahl大鼠肾组织p22phox、p47phox和NOX4 蛋白表达

图3 各组肾组织p22phox、p47phox和NOX4 蛋白免疫印迹图

2.5 泽泻汤加味方对p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表达的影响

表5示，与空白对照组比较，模型组p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表达升高 (P<0.05)；与模型组比较，缬沙坦组及各中药组p22phox、p47phox和NOX4蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组Dahl大鼠肾组织p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表达比较

3 讨论

泽泻汤加味方具有利水泄浊、健脾化痰、活血化瘀之功效。中医理论认为，上述4味药合煎共奏利水泄浊、祛痰开窍之功效。SSH属于中医水湿内停、痰浊壅盛之证。《景岳全书·肿胀》阐明了肾脏是水肿病之本，肾气对参与水液代谢脏腑有一定的促进作用，最终将各脏腑形体官窍代谢后所产生的浊液下输于肾及膀胱，在肾气的蒸化作用下分为清浊，清者再次参与水液代谢，浊者为尿液排出体外，肾气与肺、脾、三焦共同协同运化水液。现代药理研究表明，利尿剂为治疗高血压的重要药物，泽泻汤加味方的降压作用可能与其利水泄浊功效密切相关。

肾脏既是血压调节的重要器官，同时又是高血压损害的主要靶器官之一。Dahl大鼠是一种具有高血压遗传特性的近交系大鼠，这种品系的大鼠对盐负荷敏感，此类动物模型能复制出临床对盐敏感患者的情况。近期研究表明，盐、AngII和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可促进慢性肾脏疾病的进展，且验证高盐摄入会产生特定的ROS。病理情况下，ROS过表达可引起细胞氧化损伤，如肾小球系膜细胞增殖，肾小管血管内皮功能障碍或损伤，血管壁中膜肥厚，肾纤维化及出现炎症反应，发生肾损害性高血压[4]。NADPH 氧化酶抑制剂可有效抑制大鼠肾组织中 ROS 的产生，减少蛋白尿并改善肾组织病理改变[5]。

NADPH氧化酶家族有7个亚型，NOX4是肾脏较高表达的亚型，通过激活多种信号通路参与高血压肾病等肾脏疾病的氧化还原过程。研究表明，AngII-NADPH-ROS 信号通路的活化在SSH中发挥关键作用[6，7]。NADPH氧化酶被激活后，通过p47phox的丝氨酸磷酸化，然后与p67phox形成复合物，移位到细胞膜与p22phox结合形成具有活性的NADPH氧化酶复合物[8]。有研究证实，抑制p47phox可以减轻氧化应激，降低高血压和心血管重塑的发生[9]。p22phox在体内外缺氧反应中的调控作用与ROS生成有关，并对血压的调节起关键作用，大脑穹下器官中NADPH氧化酶可以通过p22phox调节血压和血管炎症[10，11]。研究表明，NADPH氧化酶抑制剂治疗相关疾病具有重要的研究意义，雷公藤红素和红杉醇分别可以抑制p47phox、p22phox位点，进而特异性地抑制NOX4的表达[12，13]。因此，抑制NADPH氧化酶的相关分子表达阻断激活ROS可以成为治疗SSH的思路。

本研究结果显示，高盐饮食诱导高血压动物模型复制成功。泽泻汤加味方干预治疗3周后血压显著下降，随着治疗时间的增加血压持续下降，证明中药泽泻汤加味方具有降低Dahl大鼠SBP的功效。中药中剂量组大鼠肾重及肾重/体质量显著降低，说明泽泻汤加味方能降低肾负荷。观察肾脏病理组织形态，PAS染色可见各中药组大鼠肾小球体积、系膜细胞及基底膜结构较好于模型组大鼠。透射电镜下观察超微结构变化，各中药组大鼠肾小球基底膜、线粒体结构及肾小管上皮细胞均优于模型组大鼠，表明泽泻汤加味方能明显改善大鼠肾脏病理组织学改变，具有肾保护作用。前期研究表明，泽泻汤加味方能够减少模型大鼠血清尿素氮、血肌酐的含量[14]。综上结果证实，泽泻汤加味方具有降低血压和肾保护作用。

泽泻汤加味方能下调大鼠肾脏组织中p22phox、p47phox和NOX4蛋白及mRNA的表达，中药中剂量组对蛋白的表达下调作用明显，中药3个剂量组均对mRNA的表达下调作用显著。其作用机制可能为泽泻汤加味方抑制Dahl大鼠肾脏组织中的NADPH氧化酶NOX4活化，通过抑制p47phox的磷酸化，影响p22phox结合形成有活性的NADPH 氧化酶复合物，进而抑制ROS的产生。AngII-NADPH-ROS通路是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的相关信号通路，其异常被认为是SSH发生的重要机制之一，其中NADPH氧化酶介导的ROS在高血压中枢神经系统信号传导中具有重要作用[15]。ROS在肾脏疾病发生发展中具有重要作用，肾小球中主要的ROS产生者是p47phox亚单位，作为关键调节因子其表达和磷酸化在肾损伤过程中的上调已被证实会加重肾损伤[16]。实验组已证实，泽泻汤加味方能显著减低大鼠肾小球系膜细胞HBZY21的ROS 表达水平[7]，可知泽泻汤加味方能通过下调ROS表达发挥肾脏保护作用。本研究中，泽泻汤加味方可能通过抑制p22phox、p47phox和NOX4的表达，抑制ROS的产生，通过阻断NADPH氧化酶信号传导，进而起到降低血压和肾保护作用。此作用机制可为泽泻汤加味方临床治疗SSH提供分子依据。