丹参酮IIA对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的影响

蒋丽 芮燕君 戴佳琪 丁高凤

世界范围内,白内障是人类致盲的最常见原因之一[1]。众所周知，老化是晶状体混浊的主要原因，然而衰老是一个不可避免的过程，因此从发病机制上寻找靶点有助于临床药物的研发[2]。老年性白内障发展过程中伴随着晶状体抗氧化能力的下降，氧化应激一方面可直接影响晶状体蛋白质的溶解度，增加晶状体的混浊；另一方面可促使人晶状体上皮细胞凋亡，这是导致白内障发生的早期事件[3]。在这方面，一些黄酮类化合物由于其安全性和抗氧化作用而受到关注。丹参酮IIA(Tan IIA)是从丹参中提取的天然活性成分，具有良好的活血化瘀、抗炎、抗氧化功效[4-5]。崔璟琳等[6]发现，丹参中的有效成分对体外培养的晶状体上皮细胞的氧化损伤有明显的保护作用，且呈现一定的剂量依赖性。核因子E2相关因子2(Nrf2)是重要的核转录因子，可调控下游血红素氧合酶-1(HO-1)的表达，Nrf2/HO-1信号通路已成为细胞抗氧化应激的主要防御机制之一[7]。本研究以过氧化氢(H2O2)诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激损伤作为模型，探讨Tan IIA对人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的调控作用及其可能机制，以期为白内障的临床治疗提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及主要试剂人晶状体上皮细胞株SRA01/04购自中国医学科学院基础医学细胞中心。Tan IIA粉末(HPLC≥98.0%)购自美国Sigma-Aldrich公司；H2O2购自上海抚生实业有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；活性氧簇(ROS)检测试剂盒和Annexin V-FITC&PI细胞凋亡试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司；CCK-8 试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒和蛋白定量试剂盒均购自美国CUSABIO公司；Oligomer-lipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Nrf2 siRNA(siNrf2)和siRNA 阴性对照均由广州锐博生物科技有限公司设计；Western blot一抗Nrf2和HO-1均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理SRA01/04细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱内培养，取处于对数生长期的细胞进行实验。将SRA01/04细胞随机分组，分别为：(1)空白组：二甲基亚砜(DMSO)预处理细胞24 h后，正常培养24 h；(2)H2O2组：DMSO预处理细胞24 h后，加入300 μmol·L-1H2O2培养24 h建立氧化损伤模型；(3)Tan IIA组：20 μmol·L-1Tan IIA溶液预处理细胞24 h后，加入300 μmol·L-1H2O2作用24 h；(4)Tan IIA+siNC组：取转染阴性对照的SRA01/04细胞，其他处理方式同Tan IIA组；(5)Tan IIA+siNrf2组：取转染siNrf2的SRA01/04细胞，其他处理方式同Tan IIA组。空白组和H2O2组预处理使用的DMSO用量同Tan IIA。

1.2.2 细胞转染设计合成针对Nrf2基因具有直接干扰作用的siRNA。将SRA01/04细胞按每孔1×104个接种于24孔板中，在不含100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)中培养。当细胞融合达到60%时，利用Oligomer-lipofectamineTM2000转染质粒将siNrf2或阴性对照siRNA转染至SRA01/04细胞，通过Western blot 检测验证转染效率后，收集转染细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞增殖活性检测参照Mok等[8]的方法进行。取SRA01/04细胞贴壁培养24 h后进行以下实验：(1)分别使用0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1的H2O2处理SRA01/04细胞，分别培养6 h、12 h、24 h、48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h后，在酶联免疫检测仪450 nm波长处测定各孔光密度，计算细胞活力。选择细胞活力在50%左右的H2O2浓度建立细胞损伤模型。(2)分别使用0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1、25 μmol·L-1、30 μmol·L-1的Tan IIA溶液处理SRA01/04细胞，分别培养6 h、12 h、24 h、48 h后，CCK-8法检测细胞光密度，计算细胞活力，选择无细胞毒性剂量用于后续实验。(3)分别使用0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1Tan IIA溶液预处理SRA01/04细胞24 h后，加入300 μmol·L-1H2O2继续作用24 h，CCK-8法检测光密度，计算细胞活力，Western blot检测各组细胞Nrf2蛋白相对表达量。

1.2.4 细胞凋亡检测取SRA01/04细胞，贴壁培养24 h后，按照1.2.1分组方法进行处理，收集各组细胞，调整细胞密度为1×106个·mL-1，用1 mL 1×结合缓冲液重悬，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶，室温避光孵育，用FACScan流式细胞仪检测染色细胞。

1.2.5 细胞ROS含量检测按11000比例用无血清培养液稀释 DCFH-DA(终浓度为10 μmol·L-1)。取SRA01/04细胞，贴壁培养24 h后，按照1.2.1 分组方法进行处理，去除细胞培养液，加入DCFH-DA孵育20 min，制成单细胞悬液，经PBS洗涤和上样缓冲液重悬后，用FACScan流式细胞仪检测各组细胞内ROS含量。

1.2.6 细胞氧化应激指标检测收集各组细胞，用细胞裂解液裂解，取上清液。将细胞裂解液与缓冲液和250 mmol·L-1H2O2混合，25 ℃培养5 min后终止反应，取10 μL终止液样品与工作液在25 ℃下培养30 min，检测各组SRA01/04细胞520 nm波长处的光密度。用标准品曲线计算细胞内CAT活性。同样按照试剂盒说明书采用酶联免疫吸附试验检测细胞内SOD和GSH-Px的含量。

1.2.7 Nrf2/HO-1通路相关蛋白检测收集各组细胞，加入100 μL含有或不含5 g·L-1Nonidet P-40的HEPES预冷裂解细胞缓冲液冰浴裂解30 min，提取细胞总蛋白和核蛋白，按BCA试剂盒说明书检测蛋白样品浓度。各组样品等量(40 μg)加样，在100 g·L-1的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳分离后，转移至聚偏氟乙烯膜上。50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h，加入Nrf2和HO-1蛋白一抗孵育过夜。第2天，加入相应的二抗室温孵育2 h，ECL化学发光法检测并记录各组细胞总蛋白中Nrf2、HO-1蛋白相对β-actin的表达量及核蛋白中Nrf2相对Histone H3的表达量。

1.3 统计分析采用 SPSS 19.0统计学软件对各项统计数据进行分析，数据分析结果以均数±标准差表示，多组间总体比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 确定H2O2和Tan IIA溶液作用于SRA01/04细胞的实验浓度和作用时间

2.1.1 确定H2O2诱导SRA01/04细胞损伤的最佳浓度和作用时间在相同作用时间点，随着H2O2浓度增加，SRA01/04细胞的存活率逐渐降低，在H2O2浓度为300 μmol·L-1、作用24 h时，SRA01/04细胞存活率为(48.86±2.62)%。因此，采用浓度为300 μmol·L-1H2O2作用24 h建立细胞损伤模型(图1A)。

2.1.2 确定Tan IIA作用于SRA01/04细胞的无毒剂量当Tan IIA预处理时间为6 h或12 h时，Tan IIA浓度≤30 μmol·L-1均能确定为无毒剂量；而当Tan IIA预处理24 h且Tan IIA浓度≥25 μmol·L-1时，SRA01/04细胞的存活率有降低趋势，与0 μmol·L-1Tan IIA处理组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。因此，≤20 μmol·L-1被认为是Tan IIA作用24 h的无毒剂量。同样，当Tan IIA预处理48 h且浓度≥15 μmol·L-1时，SRA01/04细胞的存活率有降低趋势，与0 μmol·L-1Tan IIA处理组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。因此，≤10 μmol·L-1被认为是Tan IIA溶液作用48 h的无毒剂量(图1B)。

2.1.3 确定Tan IIA溶液抑制H2O2诱导SRA01/04细胞损伤的最佳浓度当Tan IIA预处理24 h时，随着Tan IIA浓度的增加，SRA01/04细胞的存活率逐渐升高。当Tan IIA浓度为10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1时，SRA01/04细胞的存活率较H2O2组明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。然而，当Tan IIA预处理48 h时，5 μmol·L-1或10 μmol·L-1Tan IIA处理后SRA01/04细胞的存活率与H2O2组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。Western blot检测显示，随着Tan IIA浓度增加，SRA01/04细胞Nrf2蛋白表达水平逐渐升高，在20 μmol·L-1时，Nrf2蛋白相对表达量均明显高于H2O2组和5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、15 μmol·L-1Tan IIA处理组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。虽然高剂量的Tan IIA仍不能完全避免细胞活力损失，但为了更高效的研究，本研究选择20 μmol·L-1Tan IIA预处理24 h作为最佳实验浓度和作用时间用于后续实验(图1C和图1D)。

图1 确定H2O2和Tan IIA作用于SRA01/04细胞的最佳浓度和时间A：CCK-8法确定H2O2损伤细胞模型浓度；B：CCK-8法确定Tan IIA对SRA01/04细胞的无毒剂量；C：CCK-8法确定Tan IIA抑制H2O2诱导SRA01/04细胞凋亡的有效浓度；D：Western blot检测Tan IIA对SRA01/04细胞Nrf2蛋白表达的影响。注：与0 μmol·L-1 H2O2作用时相比，a P<0.05；与H2O2组相比，b P<0.05。

2.2 Tan IIA对H2O2诱导SRA01/04细胞凋亡的影响空白组、H2O2组、Tan IIA组SRA01/04细胞凋亡率分别为(6.55±0.33)%、(48.14±4.32)%、(25.30±2.58)%，3组细胞凋亡率间差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，与空白组相比，H2O2组细胞凋亡率增加(P<0.05)；而Tan IIA组细胞凋亡率则低于H2O2组(P<0.05)(图2)。

图2 显微镜下观察和流式细胞术检测空白组、H2O2组、Tan IIA组SRA01/04细胞凋亡情况

2.3 Tan IIA通过Nrf2途径影响SRA01/04细胞中氧化应激相关因子的表达与空白组相比，H2O2组SRA01/04细胞中ROS水平升高，同时CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与H2O2组相比，Tan IIA组细胞中ROS水平降低，CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Tan IIA组或Tan IIA+siNC组相比，Tan IIA+siNrf2 组细胞中ROS水平升高，CAT活性、SOD含量、GSH-Px 含量均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Tan IIA组与Tan IIA+siNC组相比，ROS水平、CAT活性、SOD含量和GSH-Px含量差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 各组SRA01/04细胞中ROS水平、CAT活性、SOD含量和GSH-Px含量

2.4 Tan IIA对SRA01/04细胞Nrf2/HO-1通路活化的影响与空白组相比，H2O2组细胞总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量以及核蛋白中Nrf2相对表达量均下调，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与H2O2组相比，Tan IIA组或Tan IIA+siNC组细胞总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量以及核蛋白中Nrf2相对表达量均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Tan IIA组或Tan IIA+siNC组相比，Tan IIA+siNrf2组细胞总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量以及核蛋白中Nrf2相对表达量均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3)。

图3 Tan IIA对SRA01/04细胞Nrf2/HO-1通路活化的影响A：空白组；B：H2O2组；C：Tan IIA组；D：Tan IIA+siNC组；E：Tan IIA+siNrf2组。与空白组相比，a P<0.05；与H2O2组相比，b P<0.05；与Tan IIA组相比，c P<0.05；与Tan IIA+siNC组相比，d P<0.05。

3 讨论

氧化应激是白内障发生和发展的重要机制之一，氧自由基可引起晶状体上皮细胞应激性损伤，最终引发细胞凋亡[9]。在本研究中，我们同样证实H2O2对SRA01/04细胞有明显的损伤作用，细胞活力下降，细胞凋亡率和ROS水平增加。而天然黄酮类化合物Tan IIA具有较强的抗氧化作用，能够保护SRA01/04细胞免受H2O2诱导的应激性损伤和凋亡。同时，Tan IIA可上调Nrf2蛋白表达，并通过促使Nrf2信号核转位进而诱导HO-1表达，激活Nrf2/HO-1信号通路，可能与Tan IIA的保护作用有关。

近年来，从植物中分离有效活性成分已成为寻找新药的主要途径之一[10]。作为丹参的脂溶性成分，Tan IIA受到了众多的关注。李洁等[11]研究表明，Tan IIA可以增强线粒体生物学功能并有效减轻氧化损伤，从而发挥神经保护作用。崔璟琳等[6]证实，丹参中的有效成分对体外培养的晶状体上皮细胞氧化损伤有明显的保护作用。本研究通过体外实验证实了Tan IIA对H2O2作用后SRA01/04细胞的抗凋亡和抗氧化作用，从而进一步扩大了我们对Tan IIA临床应用的认识。

衰老是造成白内障的首要原因，卵磷脂对氧化损伤的敏感性被认为是白内障形成的主要诱因[12]。氧化应激被认为是许多慢性疾病(包括眼部并发症和炎症过程)病理过程的关键因素。白内障高发病率与持续眼内穿透光线引起的氧化应激以及随之而来的自由基氧化剂的光化学作用有关[13]。过量的氧化剂导致抗氧化剂的减少，这反过来导致生物体中氧化-还原失衡。缺乏抗氧化系统会产生氧化应激，其特征是活性物质(ROS、羟基自由基等)水平升高[14]。ROS以其介导生理和病理生理信号转导的作用而闻名，过表达的ROS会对蛋白质、脂质和核酸等造成过氧化修饰，导致线粒体功能障碍，进而引起细胞的代谢紊乱、凋亡和坏死[15]。本研究发现，人晶状体上皮细胞SRA01/04经H2O2作用后，ROS含量和凋亡率显著上升，细胞增殖活性明显降低。经Tan IIA处理后，细胞中ROS水平降低，同时保护细胞免受脂质过氧化物产物损伤的SOD含量和保护细胞膜结构和功能不受过氧化物干扰及损害的GSH-Px含量升高，这些结果表明，Tan IIA通过抑制细胞凋亡和调节氧化应激反应保护人晶状体上皮细胞免受H2O2诱导的损伤。

有研究发现，Nrf2信号通路是细胞抗氧化应激的关键通路，通路被激活后可诱导HO-1等保护性基因的转录，进而抵抗各种刺激对机体产生的氧化应激损伤[16]。Nrf2在维持细胞稳态中起着重要作用，是调节细胞氧化还原稳态的主要因子之一。Nrf2通过调节抗氧化基因的表达，对各种内源或外源刺激引起的应激反应发挥防御机制[17]。在正常情况下，Nrf2通过与抑制蛋白Keap1结合，能够在细胞质中维持基础水平的稳定性；当Nrf2存在于氧化应激环境中时，它将从其抑制剂Keap1中分离出来，然后转移到细胞核中，Nrf2能够调控细胞质和线粒体ROS的产生[18]。Ma等[19]证实，HO-1可保护人晶状体上皮细胞免受H2O2诱导的氧化应激损伤和凋亡。而Nrf2是HO-1的主要调节因子，在氧化应激和内质网应激的相互诱导过程中被触发。细胞内ROS累积引起应激反应，引发过氧化物依赖性未折叠蛋白反应，并诱导下游信号Nrf2自磷酸化；而恢复Nrf2表达则有助于延缓卵磷脂的老化和老年性白内障的形成。在本研究中，我们通过Western blot检测和验证实验证实Tan IIA预处理可增加Nrf2蛋白核易位，进而上调HO-1蛋白的表达，说明激活Nrf2/HO-1信号通路可能是Tan IIA抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的重要机制之一。

综上所述，本研究结果表明，Tan IIA可以保护SRA01/04细胞免受H2O2诱导的应激性损伤和凋亡，其部分作用机制与Nrf2/HO-1信号通路活化有关。