305份国内外小麦种质条锈病与白粉病抗性鉴定与评价

王 鑫，宋鹏博，王笑笑，杨孟于，周 锋，吕栋云，孙道杰

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

小麦是我国重要的粮食作物之一，其安全可持续生产对保障国内口粮安全具有重要意义[1]。条锈病是一种由条形柄锈菌小麦专化型导致的气传性叶部病害[2]，白粉病是由禾布氏白粉菌小麦专化型侵染引起的气传病害，二者对小麦安全生产造成严重威胁。由于病原菌生理小种变异频繁，致使许多已有抗性基因丧失抗性，其中包括Yr1-Yr4、Yr6-Yr9、Yr17、Yr20-Yr22、Yr24-Yr29、Yr43、Pm2、Pm4a、Pm4b。因此，鉴定当前种质中的已知有效抗性基因，并结合小麦田间抗病表现明确其抗性水平，对于小麦抗病育种极为重要[3]。

传统的抗性鉴定难以快速准确地选择具有特定抗性基因的小麦品种，随着分子育种技术的不断发展，利用与有效抗性基因紧密连锁的分子标记，可以对当前的种质资源进行抗病基因检测。刘理森等[4]，陈向东等[5]，李 玮等[6]利用与抗白粉病基因或抗条锈病基因紧密连锁的分子标记对多份小麦种质材料进行了鉴定，筛选出了具有抗病的小麦种质。病原菌生理小种与寄主抗性存在协同进化关系[7]，筛选携带多效抗性基因及同时存在多数量单抗性基因的小麦种质资源，对提高小麦综合持久抗性具有重要意义。

本研究利用与两个多效抗病基因Yr18和Yr46、三个抗条锈基因Yr10、Yr15和Yr26、三个抗白粉病基因Pm8、Pm21和Pm34紧密连锁的分子标记，对本课题组收集的305份国内外小麦种质资源进行抗病基因检测，以更好地了解抗条锈病及白粉病基因在小麦种质材料中的分布情况，为小麦抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的305份小麦种质资源由西北农林科技大学小麦育种实验室收集并保存，其中70份为国外品种(系)，其余为国内地方种和审定品种。

1.2 成株期抗病性鉴定

将305份小麦材料种植在西北农林科技大学农作站、南阳试验站和驻马店驻研种业试验田，每个地点两个重复，每个材料种植2行，行长 2 m，行距25 cm，株距6.6 cm，用于病害等级调查(2020年乃近10年以来条锈病发病最重的年份)。于2020年4月下旬对田间小麦进行成株期小麦条锈病和白粉病发病情况调查。小麦病级分为0、1、2、3、4共五级，抗性水平依次为免疫(0级)、高抗(1级)、中抗(2级)、中感(3级)、高感(4级)[8]。每种病害在3个试验点分别调查2次，最终以所调查结果中最高等级为最终结果。

1.3 DNA的提取

采用CTAB法[9]提取小麦全基因组DNA，使用Thermo NanoDropTMOne/OneC超微量紫外分光光度计测DNA的浓度。

1.4 抗性基因检测

1.4.1 多效抗病基因的检测

利用两个抗病基因Yr18和Yr46对应的分子标记Cslv34和CFD71进行多效抗性基因检测，引物见表1。PCR反应体系(15 μL)为：2 μL模板DNA，7 μL Mix(DiNing),2 μmol ·L-1上、下游引物各1 μL(Sangon Biotech)，4 μL去离子水。标记Cslv34的PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性40 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36个循环; 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。标记CFD71的PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min; 95 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min， 73 ℃延伸1 min，30个循环; 73 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。标记Cslv34和CFD71的扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶在180 V下电泳检测,利用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照保存。

1.4.2 抗条锈病基因的检测

利用标记S26M47(Yr10)、Xbarc8(Yr15)和Xwe173(Yr26)对305份供试材料进行抗条锈基因鉴定，引物见表1。三个标记的PCR反应体系同1.4.1。标记S26M47的PCR反应程序为： 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸30 s，35个循环; 72 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。标记Xbarc8和Xwe173的PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性40 s， 59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，36个循环; 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物电泳及其结果观察同1.4.1。

1.4.3 抗白粉病基因的检测

选用抗白粉病基因Pm8、Pm21和Pm34对应的分子标记AF1/AF4、SCAR1400/1000、Barc144对305份材料进行检测，引物见表1。三个标记的PCR反应体系同1.4.1。标记AF1/AF4和SCAR1400/1000的PCR反应程序为： 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，62 ℃/55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环; 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。标记Barc144的PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min; 95 ℃变性1 min， 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环; 72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。标记Barc144扩增产物的电泳及其结果观察同1.4.1。标记AF1/AF4和SCAR1400/1000的扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，经DuRed核酸染料染色后，在紫外凝胶成像仪内观察并拍照。

表1 用于检测小麦抗条锈病及白粉病基因的分子标记及其引物Table 1 Molecular markers and primersof resistance genes for wheat stripe rust and powdery mildew

2 结果与分析

2.1 多效抗病基因的检测结果

305份种质中，23份材料携带Yr18基因(图1)，占比7.54%，包括碧蚂1号、偃展4110、Norin 61、内乡5号、Aca 801、ProINTA Colibr 1、Lampo、Kanto 107、Nidera Baguette 10、襄麦55、中国春、扬麦10号、CA1133、京冬22、秦农151、Fr03717、Jagger/W94-244-132、CA0998、晋麦45、KNIISH 46、丰抗2号、NSA09-3645、CA0548。4份小麦种质携带Yr46基因(图2)，占比1.31%，包括小偃6号、川麦42、川麦43、鄂恩5号。

2.2 抗条锈病基因的检测结果

对305份材料进行抗条锈病基因检测，结果显示，共检测到5份小麦种质含有Yr10基因(图3)，占比1.64%，分别为Mantol、NSA09-3645、STARSHINA、CA0548、内乡5号。在10份材料中检测到Yr15基因(图4)，占比3.28%，分别是鲁麦5号、郑州3号、洛旱2号、PH82-2、碧蚂4号、宁麦9号、宁麦8号、Mason/Jagger、Aztec、TX03A0148。Yr26基因的STS标记Xwe173未在305份小麦材料中扩增出目的片段。

2.3 抗白粉病基因的检测结果

结果显示，在100份小麦材料中检测到了Pm8基因(图5)，占32.79%，分别是陕农7859、陕麦509、石家庄15、衡7228、豫麦13、鲁麦9号、烟农18、鲁麦14、淮麦20、陕354、中麦895、阜936、西农291、85中33、新麦9408、泰山1号、豫麦21、西农1376、皖麦33、周麦25、石4185、兰考2号、中麦871、兰考906、武农148、鲁麦8号、陕715、内乡188、临抗12、周麦12、矮抗58、鲁原502、高优503、周麦30、豫麦7号、济麦21、Dorico、Lampo、中育5号、小偃81、周麦32、中育9号、周麦18、石家庄8号、豫麦50、周8425B、周麦28、豫麦2号、Kitanokaori、周麦26、中麦875、周麦16、衡观33、兰考24、鲁麦11、洛麦21、淮麦21、鲁麦15、周麦11、金禾9123、鲁麦7号、周麦22、豫麦35、中892、淮麦18、邯6172、晋麦61、周麦13、连麦2号、绵麦37、川麦46、川麦45、绵农4号、川麦52、华2459、蓉麦4号、鄂恩5号、川麦107、#575(LYFENKO)/JAGGER/4/KARL*2//PI355520/、京冬17、科衡6654、农大211、京冬22、SELYANKA、LASEN、农大212、晋麦67、Fr03725、豆麦、Jagger/W94-244-132、 F98047 G14-2INC、轮选987、丰抗2号、CA1090、京冬8号、YANA、北京841、Lovrin13、PALPICH、宁冬10。只有在金禾9123中检测到Pm21基因 (图6)。

有95份小麦种质含有Pm34基因(图7)，占31.15%，分别为鲁麦5号、偃展4110、丰产3号、陕农7859、陕麦509、西农979-005、郑州3号、安1331、鲁麦9号、鲁麦14、西农2000-7、宿0663、85中33、Barra、淄选2号、阿勃、小偃54、新麦9408、宿农6号、石4185、济麦22、11CA40、Norin 67、皖麦52、汶农14、皖23094、豫麦49、陕优225、洛旱2号、陕715、豫麦57、良星99、高优503、陕229、皖麦50、Aca 601、泰山5号、Dorico、Lampo、周麦32、周麦23、陕农981、山农20、兰考24、皖麦19、良星66、济麦19、鲁麦7号、临旱2号、新麦19、中892、小偃22、淄麦12、西农88、晋麦61、川麦44、连麦2号、绵麦37、襄麦55、鄂麦12、繁6、襄麦81、镇麦6号、绵阳19、科成麦1号、川麦45、川麦42、绵农4号、川麦52、绵阳26、川麦43、徐州25、内麦9号、扬麦15、绵麦185、川麦107、中麦175、CA1135、Fr03724、秦农151、Fr03717、Thesee、LASEN、CA1119、Magnus、Fr03711、C39、F98047G14-2INC、晋麦45、RE714、NUWEST/4/D887-74/PEW/3/LNCR//CARSTEN/GIGANT/5/MRS/CI14482//YMH/HYS/3/RON、DEZVOUS、Fr3713、Festin、CA9719、Azulon。

2.4 小麦种质中抗病基因的分布及其抗病性评价

表型鉴定发现，携带Yr18的23份材料中，对条锈病产生免疫的有3份(丰抗2号、Fr03717等)，高抗的有3份，中抗的有1份；对白粉病产生免疫的有6份(Nidera Baguette 10、扬麦10号等)，高抗的有7份，中抗的有3份。其中小麦地方品种中国春携带Yr18，该种质在小麦成株期对条锈病和白粉病都具有高抗水平。携带Yr46的4份材料中，川麦43、川麦42和小偃6号在成株期分别对条锈病产生免疫、高抗和中抗反应；鄂恩5号和小偃6号对白粉病具有中抗抗性。其中小偃6号对条锈病和白粉病同时具有成株期中抗抗性。

抗条锈病基因中，携带Yr10的5份材料中，有1份(Mantol)表现为高抗，1份(CA0548)表现为中抗。携带Yr15的10份材料中，鲁麦5号和TX03A0148表现免疫水平，Aztec表现出高抗。

对抗白粉病基因，携带Pm8的100份材料中，表现免疫的有24份(矮抗58、中麦871等)，高抗的有23份，中抗的有12份。携带Pm21的只有金禾9123表现为高抗。携带Pm34的62份材料中，表现免疫的有的21份(鲁麦5号、川麦107等)，高抗的有28份，中抗的有13份。其他具有成株期抗病性的小麦种质材料，未检测到上述基因，可能由其他基因控制其抗病性。

2.5 抗病基因组合的分布及其抗病性评价

305份材料中，两个多效抗病基因Yr18和Yr46分别检测到23和4份材料。单抗性基因与这2个多效抗病基因有多种组合，共检测到15份(表2)。其中Yr18+Pm8+Pm34组合1份(Lampo)，Yr46+Pm8组合1份(鄂恩5号)，Yr46+Pm34组合2份(川麦42、川麦43)，Yr18+Yr10组合3份(内乡5号、NSA09-3645、CA0548)，Yr18+Pm34组合5份(偃展4110、襄麦55、秦农151、Fr03717、晋麦45)，Yr18+Pm8组合3份(京冬22、Jagger/W94-244-132、丰抗2号)。鲁麦5号(Yr15+Pm34组合)和Fr03717(Yr18+Pm34组合)两个小麦品种对条锈病和白粉病同时具有免疫或高抗水平的抗性。来源于北京的小麦材料CA0548同时含有Yr10+Yr18两个抗条锈基因，对条锈病产生中抗水平。含有Pm8+Pm34组合的种质有4份(陕麦509、Dorico、晋麦61、川麦107)，其对白粉病的抗性达到免疫水平。含有Pm21+Pm8组合的小麦材料只有河北的金禾9123，对白粉病抗性达到免疫。

表2 抗病基因聚合种质及其抗病性Table 2 Polymeric germplasmswithdisease resistance genes and their disease resistance

3 讨 论

在小麦抗病育种中，已经正式命名的抗条锈病基因包括Yr1～Yr83[19-21]，在小麦及其近缘植物的65个基因座上定位了90多个抗白粉病基因及其等位变异[22-25]。然而由于白粉菌和条锈菌变异频率高、毒性增长快的特点，致使许多抗性基因对当前流行的毒性生理小种失去抗性[26-27]。因此快速明确现有种质资源的抗性水平及携带的抗性基因种类迫在眉睫。

本研究结果显示，部分小麦材料携带多个被检测基因，如Yr15+Pm34、Pm8+Pm21、Yr18+Pm8+Pm34，将其作为抗病材料进行小麦抗性育种，可使抗性基因进行正向累积或者使材料具备抵抗多种病害的能力[28]，从而提高小麦综合抗病性。有110份种质中未检测到被测的8个基因，其中，有19份小麦种质对条锈病表现出高抗或免疫，对白粉病表现出高抗或免疫的种质高达56份，推测它们可能携带其他抗性基因，其中，济宁16、Sagittario、Klein Flecha、鲁麦6号、WGRC10/3/KS93U69 sib/TA2455//KS93U69/4/JAGGER、秦农731、Fr03733、Darius、Soissons、洋小麦、MV LAURA等11份材料对条锈病和白粉病均表现出免疫，这些种质多为国外引进，且暂未其所携带抗性基因的报道，所以在以后的抗病育种工作中可以对其进一步分析并合理利用。鲁麦5号、陕麦509、Fr03717和川麦45等种质对于小麦条锈病和白粉病的综合抗性呈现高抗水平，并且在本研究中已经明确它们所携带的抗性基因，充分利用这些具有优良综合抗性的种质资源，可减少小麦生产中因病害造成的损失。

Yr18和Yr46是多效抗性基因，二者对于小麦锈病和白粉病均具有部分抗性[29- 30]。本研究中，检测到携带Yr18基因的材料仅有23份，其中13份来源于国外，总体检出率很低。这与前人研究结果基本相似，如董 娜等[29]在348份国内小麦种质中进行Yr18基因检测，检出率仅为2.01%，李敏州等[31]在115份陕西小麦品种(系)只检测到中研196、西农023、西农928等3个材料含有Yr18基因，薛文波等[32]在74个国内主栽小麦品种里未检测到Yr18基因。本研究中，只有4份种质携带Yr46基因，3份表现出中抗以上的抗条锈性，仅鄂恩5号中感条锈病，具体原因有待进一步分析。未检测到同时携带这两个多效抗性基因的材料。在305份材料中，抗白粉病基因Pm8和Pm34检出率均高于Pm21，仅金禾9123携带Pm21基因。这与刘理森等[4]在241份小麦品种(系)中只检测到金禾8431和俊达129携带Pm21基因的情况基本一致，说明现有小麦种质存在该基因的种类和数量很少。作为重要的抗白粉病基因资源，在以后应该合理利用且使之广泛分布。一个优质小麦品种需对多种病害具备抗性，所以我们应选育出综合抗性优良的小麦种质。董 娜等[8]在39份国外引进的小麦种质中只筛选出2份(澳阿优1号和bermude)兼具条锈病和白粉病抗性的种质资源。肖万婷等[33]对66份四川省小麦区试品种(品系)的条锈病、白粉病和赤霉病等抗性鉴定和分析，得到17份种质对白粉病和条锈病兼具抗性，但没有一个小麦品种(品系)兼具三种病害的抗性。在本试验中，共检测到15份兼具条锈病和白粉病抗性的国内外小麦种质，说明当前的小麦种质综合抗性较差。

戴妙飞等[34]利用Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26基因对ICARDA的203份小麦种质进行了抗条锈病基因分析，认为“一因多效”基因Yr18与Yr9和Yr17基因组合可以产生更高水平的抗性。本研究结果表明，多类型抗性基因组合可提高小麦的综合抗病性。综上所述，单个多效抗性基因与抗条锈基因或抗白粉病基因组合，可显著提高小麦的综合抗病能力。“一因多效”抗病基因是一种重要的基因资源，可在明确现有种质资源所含抗病基因的基础上，通过聚合育种的方式将多个多效抗病基因集中在一个品种上，从而增强小麦的抗病能力，减缓目前流行毒性生理小种的变异速度，以此保障我国小麦的安全生产。