结直肠癌组织PEA15、MSI-2的表达与肝转移及预后的关系

李昱江，张东丽，钱云，伏亦伟，杨斌，刘翠霞

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于消化系统恶性肿瘤的第三位，仅次于胃癌和食管癌[1]。但近年来，随着人们生活和饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率显著上升，且发病年龄呈年轻化趋势[2]。由于结直肠癌发病隐匿，患者早期临床症状不明显，大多数患者确诊时已处于中晚期，致使术后5年生存率低于西方发达国家。肿瘤转移是影响患者预后的重要因素，其中肝脏是结直肠癌最常见的转移靶器官之一[3]。目前对于结直肠癌肝转移的发生机制仍未完全明确。星形胶质细胞磷酸化蛋白15(PEA15)最初在星形胶质细胞中被发现，其编码序列位于染色体1q21-22上，其基因序列在哺乳动物基因组中具有高度保守性[4]。研究表明，PEA15在肝癌、肺癌中高表达[5-6]。MSI-2是Musashi蛋白家族的重要成员，具有调节细胞增殖、分化的作用[7]。已有研究表明，在胃癌中存在MSI-2的异常高表达[8-9]。由于结直肠癌的发生和肝转移与细胞的增殖、分化和凋亡异常有密切关系，PEA15、MSI-2水平可能反映结直肠癌肝转移情况和预后，但目前对于结直肠癌组织PEA15、MSI-2的表达情况及其与肝转移、预后的关系仍缺乏相关报道。鉴于此，现分析PEA15、MSI-2在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌肝转移及预后的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月—2017年12月江苏省泰州市人民医院/南通大学第五附属医院消化内科收治结直肠癌患者180例，其中男106例，女74例，年龄42～75(61.27±7.96)岁；原发癌部位：结肠114例，直肠66例；癌灶直径2～8(5.87±2.03)cm；组织分化程度：低分化42例，中分化57例，高分化81例；浸润深度：T1 39例，T2 59例，T3 51例，T4 31例；发生肝转移38例，未发生肝转移142例；发生淋巴结转移106例，未发生淋巴结转移74例；病程7～14(10.12±2.68)年；结直肠癌诱因：高脂低纤维饮食81例，肥胖84例，其他15例；分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期71例，Ⅲ期61例；基础病：高血压35例，糖尿病29例；家族遗传史38例。本研究经医院伦理委员会批准(NTDX-05YY-LS20141227)，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①所有患者均完成手术且获取标本，术后经病理检查确诊为结直肠癌；②患者初次就诊，肿瘤为首次发生，病历资料完整；③患者本次就诊前未经过放疗、化疗及生物学治疗。(2)排除标准：①合并自身免疫疾病及结直肠外其他脏器同时发生原发性肿瘤者；②术前及术后6个月内除肝脏外存在其他器官肿瘤转移者；③患者身体状况较差，预计术后生存时间<6个月者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 结直肠癌组织PEA15、MSI-2表达检测：(1)检测方法：术中准确切取结直肠癌及距离肿瘤边缘3 cm以上的癌旁组织标本，经10%甲醛固定后石蜡包埋处理，烘烤载玻片同时将蜡块组织切成厚4 μm的连续切片。上述蜡块组织切片经梯度浓度乙醇溶液水化，放置在不同浓度乙醇溶液中各5 min；枸橼酸盐缓冲液冲洗后放入高温高压环境进行抗原修复10 min；滴加3%过氧化氢(购自北京中杉金桥生物有限公司)反应5 min，枸橼酸盐缓冲液冲洗；向切片中滴加山羊血清(购自北京中杉金桥生物有限公司)反应5 min以封闭抗原，分别加入兔抗人PEA15单克隆抗体、MSI-2单克隆抗体(购自英国abcam公司)，4℃下湿盒孵育过夜，加入兔来源生物学二抗反应2 h，DAB显色(购自北京中杉金桥生物有限公司)，苏木素复染，梯度乙醇溶液脱水中性树胶封片。以枸橼酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照，将已知阳性标本作为阳性对照，操作按说明书进行。(2)结果判定：采用半定量积分法对结果进行赋分[10]，每张切片在400倍显微镜(日本OLYMPUS，型号：CKX41)下随机观察10个视野：①染色程度计分，无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。②阳性细胞所占百分比计分，≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。将2项结果乘积作为总分，≥4分为阳性，<4分为阴性。

1.3.2 随访情况： 患者术后随访3年，随访日期截至2020年12月31日，并根据手术情况、术后病理及随访期间影像学诊断结果确定是否存在肝脏转移。

2 结 果

2.1 不同组织PEA15、MSI-2表达比较 结直肠癌患者癌组织中PEA15、MSI-2阳性表达率[62.22%(112/180)、71.11%(128/180)]显著高于癌旁组织[12.22%(22/180)、14.44%(26/180)]，差异有统计学意义(χ2=96.288、118.063，P均=0.000)， 见图1。

2.2 结直肠癌组织中PEA15、MSI-2表达在不同临床病理特征中比较 不同性别、年龄、原发癌部位、癌灶直径的患者结直肠癌组织中PEA15、MSI-2阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)，中低分化、癌灶浸润深度T3～T4、淋巴结转移患者结直肠癌组织中PEA15、MSI-2阳性表达率显著高于高分化、癌灶浸润深度T1～T2、无淋巴结转移患者(P<0.01)，见表1。

表1 结直肠癌组织中PEA15、MSI-2表达在不同临床病理特征中比较 [例(%)]

2.3 有无肝转移患者结直肠癌组织中PEA15、MSI-2表达比较 肝转移患者(38例)结直肠癌组织中PEA15、MSI-2阳性表达率[92.11%(35/38)、97.37%(37/38)]显著高于无肝转移患者(142例)[54.23%(77/142)、64.08%(91/142)]，差异有统计学意义(χ2/P=18.299/0.000、16.166/0.000)。

2.4 结直肠癌组织中PEA15、MSI-2表达的相关性 Pearson相关分析显示，结直肠癌患者癌组织中PEA15阳性表达率与MSI-2阳性表达率呈正相关(r=0.575，P=0.000)。

注： A.PEA15 在癌旁组织中表达阴性，无着色;B.PEA15在结直肠癌组织中表达阳性;C.MSI-2在癌旁组织中表达阴性，无着色；D.MSI-2在结直肠癌组织中表达阳性；所示结直肠癌细胞病理性核分裂相，包浆棕黄色

2.5 结直肠癌组织中不同PEA15、MSI-2表达情况患者预后比较 随访患者3年，失访12例(6.67%)，完成随访168例； 至随访结束死亡64例(38.10%)，存活104例( 61.90%)。PEA15阳性、阴性患者生存率分别为47.22%(51/108)、88.33%(53/60)，中位生存期分别为24.55个月、34.31个月；MSI-2阳性、阴性患者生存率分别为53.66%(66/123)、84.44%(38/45)，中位生存期分别为25.07个月、33.73个月；经Log-rank检验发现，结直肠癌组织PEA15阴性、MSI-2阴性患者生存曲线显著优于PEA15阳性、MSI-2阳性患者(χ2=26.436、22.896，P均=0.000)，见图2。

注：PEA15.星形胶质细胞磷酸化蛋白

3 讨 论

目前临床上对于结直肠癌的治疗主要采用手术、放疗、化疗、分子靶向治疗及免疫治疗等[11]。随着治疗技术的不断提升和药物的不断开发，我国结直肠癌患者预后和生活质量随之改善，但结直肠癌患者的生存率仍低于发达国家。结直肠癌转移是造成患者生存率降低的重要原因，相比其他恶性肿瘤，结直肠癌是一种侵袭性较高的恶性肿瘤，易发生远处转移[12-15]。有报道显示，结直肠癌患者发生肝转移几率约为25%，全病程发生肝转移的比例高达40%～50%[16-18]。因此研究结直肠癌肝转移的发生机制，对于指导结直肠癌诊断、治疗及预后判断具有重要的意义。

本研究发现，结直肠癌患者癌组织中PEA15、MSI-2阳性表达率升高。其中，PEA15是一种分子量为15 kD的磷酸化蛋白，最初在星形胶质细胞中被发现，后来研究证明，PEA15广泛存在于不同组织细胞中，具有调节凋亡、信号转导、调节糖代谢等功能，是一种重要的多功能蛋白[19]。Jiang等[20]报道，PEA15可通过与ERK1/2靶向结合，起到抗细胞凋亡、促进细胞增殖的功能。近年来有研究报道，PEA15还与恶性肿瘤的发生有关，但PEA15在肿瘤中可能具有双重调节作用[21]。Tang等[22]报道，在肝细胞癌中PEA15可通过与ERK1/2靶向结合，起到促进肝细胞癌增殖和侵袭的作用。Xie等[23]报道，在乳腺癌中PEA15可促进ERK磷酸化，进而促进乳腺癌细胞的侵袭。而Gawecka等[24]报道，在神经母细胞瘤中PEA15可抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果与Tang等[22]报道相符，结合文献分析PEA15可能通过与ERK1/2靶向结合，起到抗结直肠细胞凋亡、促进直肠细胞增殖的作用，进而促进结直肠癌发生。MSI-2是由328个氨基酸组成的蛋白，其氨基酸末端序列有2个高度保守的RNA识别结构域，这2个结构域又分别包含2个核糖核蛋白，MSI-2的RNA识别结构域可以直接识别靶RNA，并与之结合，从而起到调控细胞增殖和分化的作用[25]。近年来研究发现，MSI-2与肿瘤的发生、发展和转移存在密切关系[26]。Choi等[27]报道，MSI-2可通过下调Bax，上调Bcl-2，抑制细胞凋亡，促进胃癌细胞增殖。Sugai等[28]报道，沉默MSI-2后，细胞周期蛋白D1表达水平降低，P21表达水平升高，细胞凋亡比例增加，并认为MSI-2可通过促进周期蛋白D1表达，抑制P21表达促进细胞增殖。本研究结果提示，在结直肠癌发病过程中，MSI-2可能通过下调Bax，上调Bcl-2，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖；促进周期蛋白D1表达，抑制P21表达促进细胞增殖等引发结直肠细胞癌变。

本研究还发现，PEA15、MSI-2与结直肠癌分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关，结直肠癌患者癌组织中PEA15阳性表达率与MSI-2阳性表达率呈正相关，提示两者可能在结直肠癌发生、发展和转移中起到协同作用，其具体机制有待于进一步研究证实。

肝脏是结直肠癌最常见的转移靶器官之一，但目前对于结直肠癌肝转移的机制仍未完全明确。本研究结果提示，PEA15、MSI-2在结直肠癌肝转移中也发挥了重要作用，分析PEA15、MSI-2可能通过调控ERK1/2、Bax、Bcl-2、周期蛋白D1、P21等促进结直肠癌的肝转移。结直肠癌患者PEA15、MSI-2表达情况也与患者预后密切相关，提示临床上可通过检测结直肠癌组织PEA15、MSI-2表达情况为结直肠癌患者预后判断提供依据。

综上所述，结直肠癌组织中存在PEA15、MSI-2异常高表达，两者表达情况与结直肠癌分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关，且两者表达呈正相关。除此之外，PEA15、MSI-2表达水平与结直肠癌肝转移有密切关系，PEA15、MSI-2阳性表达患者总体预后较PEA15、MSI-2阴性患者差，提示PEA15、MSI-2可能在结直肠癌肝转移的诊断和预后判断中具有一定价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李昱江：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张东丽、钱云：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；伏亦伟、杨斌：进行统计学分析；刘翠霞：提出研究思路，分析试验数据，论文审核