非小细胞肺癌组织中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平及临床意义

黄祥，魏丹丹，王云，鲍捷

在世界范围内肺癌发病率、病死率均较高，是癌症死亡的主要原因之一，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌2个主要类型，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的85%[1]。肺癌患者预后状况主要依赖于临床的早期诊断和早期治疗，其中手术切除是治疗肺癌的有效手段，然而其5年术后生存率仍不高[2]。寻找与肺癌发生发展及预后相关的生物标志物，对改善预后有重要意义。微小RNA-454-3p(microRNA-454-3p，miR-454-3p)在多种类型的癌症中均异常表达，可发挥致癌或抑癌基因的作用，且研究表明，miR-454-3p在肺癌中高表达[3-5]。胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)在结直肠癌、胃癌等肿瘤细胞中表达水平均下降[6-7]。通过生物信息学预测网站miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)预测发现，miR-454-3p与CPEB1存在靶向结合位点。推测miR-454-3p可能靶向调控CPEB1进而参与肺癌的发生发展。本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测非小细胞肺癌组织中miR-454-3p、CPEB1 信使RNA(mRNA)表达，探讨二者与临床病理特征及预后的关系，以期为非小细胞肺癌患者治疗提供新靶点，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年4月—2016年3月在中国科学院合肥肿瘤医院经胸部影像学及组织病理学等确诊为非小细胞肺癌患者96例，术中取其癌组织设为肺癌组，癌旁正常组织为对照组。其中男59例，女37例，年龄44～76(56.48±10.24)岁，≤55岁43例，>55岁53例；有吸烟史40例，无吸烟史56例；肿瘤直径≤3 cm 50例，>3 cm 46例；病理类型：腺癌41例，鳞癌55例；有淋巴结远处转移者42例，无淋巴结远处转移者54例；分化程度：中/高分化55例，低分化41例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期39例。本研究经中国科学院合肥肿瘤医院伦理委员会批准(批号LS-20140317)。患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①患者均符合“中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)”中关于非小细胞肺癌的诊断标准[9]；②均为初治患者，患者术前未接受过化疗、放疗等辅助治疗；③病历资料及影像学检查信息完整者。(2)排除标准：①有严重肝肾功能异常及其他急慢性感染性疾病者；②有其他肺部疾病者；③妊娠期及哺乳期妇女；④伴有其他部位恶性肿瘤或有恶性肿瘤史者。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平测定： 采用RNA提取试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司)及反转录试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取肺癌组织总RNA并反转录为cDNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRT-PCR仪(型号7300，美国ABI公司)对miR-454-3p、CPEB1 mRNA及其内参(miR-454-3p以U6作为内参，CPEB1 mRNA以GAPDH作为内参)进行扩增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。qRT-PCR反应体系：cDNA(50 ng/μl)1 μl，qPCR SYBR®Green Master Mix(荧光定量PCR试剂，武汉纯度生物科技有限公司) 5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，ddH2O 3.2 μl。每份样品设3个重复孔，采用2-△△CT法计算组织miR-454-3p、CPEB1 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 随访： 采用电话或门诊等方式对患者随访5年，术后第1年每月1次，术后第2年每3个月1次，2年后每6个月1次。患者生存期从手术之日起计算，随访时间截止到2021年3月31日，统计5年内患者的生存情况。

2 结 果

2.1 2组miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平比较 肺癌组miR-454-3p表达水平高于对照组，CPEB1 mRNA表达水平低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平比较

2.2 癌组织中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平在不同临床病理特征中比较 以患者癌组织中miR-454-3p(均值1.56)、CPEB1 mRNA(均值0.67)表达水平为界，将患者分为miR-454-3p低表达亚组47例，miR-454-3p高表达亚组49例，CPEB1 mRNA低表达亚组50例，CPEB1 mRNA高表达亚组46例。结果显示，患者癌组织miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平在不同性别、年龄、吸烟史、分化程度中比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在不同肿瘤直径、病理类型、淋巴结远处转移、TNM分期中比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 肺癌患者癌组织中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平在不同临床病理特征中比较 [例(%)]

2.3 癌组织中miR-454-3p与CPEB1 mRNA表达水平的相关性 非小细胞肺癌患者癌组织中miR-454-3p与CPEB1 mRNA表达呈负相关(r=-0.524，P=0.000)。

2.4 患者癌组织中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平与预后的关系 采用Kaplan-Meier法分析癌组织中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平与患者生存率的关系，结果显示96例患者5年存活46例，死亡50例。miR-454-3p高表达患者5年生存率34.69%(17/49)低于miR-454-3p低表达患者61.70%(29/47)，差异有统计学意义(χ2=7.012，P=0.008)；CPEB1 mRNA高表达患者5年生存率58.70%(27/46)高于CPEB1 mRNA低表达患者38.00%(19/50)，差异有统计学意义(χ2=4.112，P=0.043)。

2.5 影响非小细胞肺癌患者预后的多因素Logistic回归分析 以肺癌患者是否死亡为因变量，以miR-454-3p、CPEB1 mRNA、肿瘤直径、病理类型、淋巴结远处转移、TNM分期为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，miR-454-3p高表达、淋巴结远处转移是影响非小细胞肺癌患者死亡的独立危险因素(P<0.05)，CPEB1 mRNA高表达是影响患者死亡的保护因素(P<0.01)，见表4。

表4 影响非小细胞肺癌患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

肺癌是一种源于支气管黏膜的高度恶性肿瘤，其具体的分子机制尚不明确，尽管近年来其治疗方法更加个体化和多样化，但其预后和疗效仍不十分理想，严重威胁患者的生命健康[10-12]。近年来，分子靶向治疗在肺癌患者中已取得了较大进步，可有效改善预后，且疗效有持续作用，为晚期肺癌患者带来新希望[13-14]。但仍有部分患者未从中获益，因此，需探索更多新的分子靶向生物标志物来满足临床需求。

许多miRNA可通过调控靶基因表达，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[15-18]。miR-454-3p是近年来发现的参与多种肿瘤生物过程的miRNA[19-20]。CPEB1是一类特殊序列的mRNA结合蛋白，它在配子形成、细胞衰老、癌症病因等方面发挥重要作用，控制健康与疾病的转化。CPEB1可通过调控mRNA poly(A)的长度影响翻译过程[21-22]。Hui等[23]研究结果显示，miR-454-3p通过过表达下调CPEB1进而抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果中，miR-454-3p在非小细胞肺癌组织中的表达水平高于对应的癌旁正常组织，CPEB1 mRNA表达水平低于癌旁正常组织，且在肺癌组织中二者表达水平呈负相关，miR-454-3p表达趋势与Jin等[5]在肝细胞癌中研究结果相符，但miR-454-3p、CPEB1表达与Hui等[23]报道二者在胶质母细胞瘤中的表达趋势不相符，分析其表达差异可能是由于miR-454-3p、CPEB1在胶质母细胞瘤和肺癌中调控的通路及发挥的作用不一致，提示miR-454-3p可能通过高表达下调CPEB1进而促进肺癌的发生发展。本研究中患者癌组织miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平与肿瘤直径、病理类型、淋巴结远处转移、TNM分期有关。提示miR-454-3p、CPEB1可能与肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭等行为密切相关，推测高表达的miR-454-3p靶向下调CPEB1表达水平，CPEB1调控特殊时期mRNA poly(A)的长度，进而调控mRNA多聚腺苷化的作用减弱，最终影响翻译过程和细胞周期，增加恶性转化的发生；亦或CPEB1表达下调后使细胞黏附力降低，可能导致上皮间质转化，增加癌细胞迁移和侵袭能力。此外，本研究发现miR-454-3p高表达、CPEB1 mRNA低表达的患者5年生存率较低，miR-454-3p高表达是影响非小细胞肺癌患者死亡的独立危险因素，CPEB1 mRNA高表达是影响患者死亡的保护因素。提示临床医师可通过密切监测miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达水平是否异常，及时调整治疗方案，阻止不良预后发生。

综上所述，非小细胞肺癌组织中miR-454-3p呈高表达，CPEB1 mRNA呈低表达，与非小细胞肺癌发生发展及预后有密切联系，对非小细胞肺癌调控机制的进一步研究有重要作用。此外，本研究可能为提高非小细胞肺癌患者诊疗效果提供新思路，对今后寻找新的治疗靶点起到积极的推动作用。然而本研究存在不足之处，miR-454-3p、CPEB1 mRNA表达可能与肿瘤位置、患者个体状态等各方面因素有关，有待今后纳入更多样本和影响因素进行多中心的前瞻性研究来进一步验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

黄祥：设计研究方案，课题设计，实施研究过程，论文撰写；魏丹丹：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；王云：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；鲍捷：进行统计学分析