妇科千金胶囊与妇科千金片指纹图谱的建立及其比较分析

粟倩 唐洁 张鹏 廖颖妍 谢菁琛 龚云 林丽美

〔摘要〕 目的 建立妇科千金胶囊与妇科千金片的指纹图谱，为两者鉴别与质量评价提供实验依据。方法 采用高效液相色谱法对40批妇科千金胶囊与40批妇科千金片进行测定，结合聚类分析、模式识别分析、相似度评价等对其进行比较。结果 首次建立了妇科千金胶囊与妇科千金片的指纹图谱，共确定了23个共有峰，指认出了穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯两个成分。聚类分析以及模式识别分析均可以明显地将其分为两类，并确定了穿心莲内酯为千金胶囊与妇科千金片的差异性成分。结论 该方法重复性好、准确率高，结合各类分析方法可以明确地区分妇科千金胶囊与妇科千金片，可用于对妇科千金胶囊与妇科千金片进行质量控制与评价。

〔关键词〕 妇科千金胶囊;妇科千金片;指纹图谱;聚类分析;模式判别

〔中图分类号〕R284.1       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.010

Establishment and Comparative Analysis of Fingerprint Chromatogram of Fuke

Qianjin Capsule and Tablet

SU Qian1，2， TANG Jie1，2， ZHANG Peng2，3， LIAO Yingyan1，2， XIE Jingchen1，2， GONG Yun2，3*， LIN Limei1，2*

（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Zhuzhou Qianjin Pharmaceutical Co.， Ltd， Zhuzhou， Hunan 412007， China）

〔Abstract〕 Objective To establish the fingerprints of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet， so as to provide experimental evidence for their identification and quality evaluation. Methods High performance liquid chromatographic method was developed to establish the fingerprint of 40 batches Fuke Qianjin Capsule and 40 batches Fuke Qianjin Tablet and the quality assessment was achieved by cluster analysis， pattern recognition analysis and similarity evaluation. Results It was the first time to establish the HPLC characteristic fingerprints of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet. There were 23 common peaks in the fingerprints. Two components were identified as andrographolide and dehydrated andrographolide by comparing with reference standards. 80 batches of different capsules and tablets were obviously divided into two groups by cluster analysis and pattern recognition analysis and the results of classification were consistent， and andrographolide were determined as the main different chemical components of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet. Conclusion This method can distinguish the Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet combined with various analysis methods with good repeatability and high accuracy. It can be used to control and evaluate the quality of Fuke Qianjin Capsule and Fuke Qianjin Tablet.

〔Keywords〕 Fuke Qianjin Capsule; Fuke Qianjin Tablet; fingerprint; cluster analysis; mode identification

婦科千金胶囊/片是妇科常用中成药，由千金拔、金樱根、功劳木、穿心莲、当归、单面针、鸡血藤以及党参8味中药材组成，是最早一批收载入国家基本药物管理的中成药[1]。妇科千金片于1979研制成功，妇科千金胶囊在2002年获新药证书，妇科千金片的研制成功为后来妇科千金胶囊的发展奠定了基础，起到了关键性的作用。该方具有清热除湿、活血解毒、益气补血等功效，临床常用于治疗湿热瘀滞之带下、腹痛、慢性盆腔炎、慢性前列腺炎、子宫内膜炎、慢性宫颈炎等[2-3]。目前，多数研究[4-6]着重于妇科千金片/胶囊药效验证，两者的指纹图谱比较鲜有学者研究。妇科千金片/胶囊虽由相同药材组成，但两者制备工艺迥异，二者在成分方面的异同尚未可知。因此，本文在建立两者指纹图谱的基础上并进行比较，寻找其共同点和差异性，为二者建立既具有一致性又兼顾差异性的质量控制标准提供参考。

模式识别是一个综合、交叉的科学领域，广泛运用于多个学科的分析工作，在中药指纹图谱数据分析中十分常见。模式识别通过对识别对象的原始数据进行提取，优选出能够反映对象某一方面的特征参数，根据相似度评价将具有相似性的数据归为一类[7]。目前，最常用的方法是主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination

analysis， OPLS-DA），具有准确、简便、除繁为简等优点。因此，本文采用PCA与OPLS-DA结合聚类分析等计量学手段对妇科千金片/胶囊指纹图谱数据进行对比分析，寻求差异，以期为两者的质量标准及鉴别提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1  主要仪器

Waters2695高效液相色谱系统（包括Empower 工作站、四元梯度泵、紫外检测器，美国Waters公司）;QUINTIX224-1cm分析电子天平（奥多利斯科学仪器公司）;KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;Microfuge20R高速离心机（德国eppendorf公司）;Direct-Q 5 UV超纯水机（苏州赛恩斯仪器公司）;Epic C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）色谱柱（北京东方银锐科技有限公司）;0.22 μm微孔滤膜（上海兴亚净化股份有限公司）。

1.2  主要试剂

80批样品均由株洲妇科千金药业提供，具体见表1（S1～S40为妇科千金胶囊，S41～S80为妇科千金片）;穿心莲内酯（YJ-110797，中国食品药品检定研究院）;脱水穿心莲内酯（YJ-110854，中国食品药品检定研究院）;甲醇（德国Merck公司色谱纯）;乙腈（美国Fisher公司色谱纯）;甲酸（天津化工研究所分析纯）;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1  色谱条件

Epic C18色谱柱（250 mm×406 mm，5 μm）;流动相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，5% B;10～50 min，5%～30% B;50～70 min，30%～90% B;70～80 min，90% B）;柱温30 ℃;进样体积10 μL;流速1 mL/min。

2.2  对照品溶液的制备

精密称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，加甲醇溶解制成质量浓度分别为0.408、0.163 mg/mL的混合对照品储备液。

2.3  供试品溶液制備

精密称定妇科千金胶囊及妇科千金片0.5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声提取60 min，取出冷却至室温，用70%甲醇补足失重。离心取上层清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得[2，8]。

2.4  条件优化

2.4.1  最佳波长的确定  通过对254、268、280、316、320、326、360 nm波长进行筛选，发现在254 nm波长下，色谱峰数量最多，峰面积较大，峰分离效果较好。具体见图1。因此，实验选择在这个波长下对药材的指纹图谱进行分析。

2.4.2  提取溶剂的优化  通过对比不同浓度甲醇（50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇溶液）提取对指纹图谱的影响，结果如图2，可以看出在不同浓度下的指纹图谱相似度很高，并没有较大的区别，通过对每个峰的峰型以及峰高、分离度方面考虑，其中又以甲醇浓度70%效果最好，因此，本实验考虑提取溶剂为70%甲醇。

2.4.3  提取时间的优化  不同提取时间（20、30、40、50、60 min）对药材的指纹图谱的影响没有明显的差别，在30～60 min间图谱各个峰面积相差较小，说明超声提取30 min时药材中的有效成分已基本提取完全。因此，为了提高实验效率，考虑将提取时间30 min作为后续实验条件。见图3。

2.5  方法学考察

2.5.1  精密度实验  取同一份样本S1，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，结果显示各色谱峰的峰面积与保留时间RSD<3%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性实验  取同一份样本S1，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项条件下测定，测得各对照品共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均<3%，表明该方法重复性良好。

2.5.3  稳定性实验  取同一份样本S1，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，计算各色谱峰峰面积与保留时间的RSD值，结果显示RSD<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6  指纹图谱建立

80批样本按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，将80批样本色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行分析，确定共有峰、计算指纹图谱相似度以及生成对照指纹图谱。采用SIMCA-P 13.0软件与SPSS 22.0软件进行聚类、主成分等分析。共确定了23个共有峰，得到妇科千金胶囊与妇科千金片叠加图如图4，对照指纹图谱和混合对照品色谱图对比如图5，通过对照品比对得知19、22号峰分别为穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯。

2.7  相似度评价

将80批成品（S1～S40批为妇科千金胶囊，S41～S80批为妇科千金片）数据进行分析，计算所有批次成品的相似度，结果如表2所示，除了S20样品相似度为0.896以外，其余79批药材指纹图谱相似度均大于0.9。表明妇科千金胶囊与妇科千金片指纹图谱总体上相似，其产生的差异部分可能与不同制备方式、药材的不同产地等有关。

2.8  聚类分析

聚类分析是对具有一定相似性的数据进行分析分类的统计分析技术。将一组研究对象分为不同的类，同类间的数据具有较大的相似性，不同类之间具有明显的差异[9]。以妇科千金胶囊与妇科千金片共有峰峰面积为变量，采用SPSS 22.0统计软件进行聚类分析，当欧式距离平方和为20时，80批数据可以分为两类，一类为妇科千金胶囊，另一类为妇科千金片，能够有效区分两种不同的剂型。结果见图6。

2.9  PCA

PCA是对众多变量数据进行处理，删除重复的变量，优选出尽可能少的能反映原来指标信息的变量的一种多元统计分析方法。这些变量之间具有明显差异，通过这些变量分析找到各样本之间的相似与疏远关系[10]。为综合评价妇科千金胶囊与妇科千金片的差异，将80批样品共有峰数据导入SIMCA 13.0软件进行PCA，结果见图7，可以看出妇科千金胶囊（S1～S40）与妇科千金片（S41～S80）之间具有明显的界限，能够进一步进行两种不同剂型的区分。

2.10  OPLS-DA

OPLS-DA是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，通过分解X、Y矩阵提取主成分，建立样本变量与分类变量之间的回归模型，从而来判断研究对象的分类[11-12]。为了考察两者间的相似性与差异性，对共有峰数据进一步分析，由模型验证的参数图可知，R2Y=0.96，Q2Y=0.954，说明该模型区别及预测程度良好，从OPLS-DA得分图（图8）同样可以看出两者具有明显的区分。

2.11  差异标记物的筛选以及鉴定

根据OPLS-DA模型的VIP值来筛选导致差异性的主要成分，提取模型中23个变量的VIP值，一般认为VIP>1的变量对分类起着关键作用。如图9所示：14号峰、5号峰、15号峰、8号峰、1号峰、12号峰、9号峰、7号峰、13号峰、4号峰、23号峰、16号峰、10号峰、2号峰、19号峰共15个峰的VIP均大于1。说明这些成分是引起妇科千金胶囊与妇科千金片成分差异的主要标志性成分，其中19号峰为穿心莲内酯。

3 讨论

本实验对检测波长210、254、268、280、320、360 nm，提取浓度50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇以及超声提取时间30、40、50、60 min进行了优选。最终确定采用色谱柱为Epic C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸，检测波长为254 nm，70%甲醇提取，超声提取30 min，得到的HPLC特征指纹图谱色谱峰较多，峰型美观，基线较平稳，分离效果较好，此方法简单易行、稳定可靠、重复性好。

本文对40批妇科千金胶囊与40批妇科千金片建立了特征指纹图谱。经过软件比对确定了23个共有峰。通过标准品指认得到其中2个峰对应的化合物分别为穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯，同时两者也是《中华人民共和国药典》中妇科千金片及妇科千金胶囊的质控指标，而其中穿心莲内酯为妇科千金片和妇科千金胶囊的差异性成分。片剂与胶囊大体上相似度较高，但各个峰的峰面积差异较大，胶囊组各个峰响应值均明显大于片剂组。聚类分析以及模式识别分析结果均显示两者具有明显的区分，推断两者差异可能是由于妇科千金胶囊采取醇提加水提的制备方式，而片剂采用水提加药材粉末的制备方式，造成了胶囊组各成分含量均高于片剂组。这也说明不同剂型中成药不仅在服用简便程度上有区别，药效物质基础也会有所差异。

本文首次建立了妇科千金胶囊与妇科千金片的比较指纹图谱，并结合模式识别对妇科千金胶囊与妇科千金片进行评价。与前期仅报道的妇科千金片的指纹图谱[13]相比，本文将株洲千金药业股份有限公司的另一市场占有剂型妇科千金胶囊也作为研究对象，在相同条件下同时建立处方一致的妇科千金胶囊与妇科千金片指纹图谱，通过相似性评价和模式识别等比较二者的相似性和差异性，不仅为该品种的质量控制提供参考，增加市场对于药品的选择依据，也为后期市场需求推出其他剂型提供理论基础。

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