不觉晓口服液对小鼠血清和肝脏抗氧化指标的影响

胡光，王芳，郎朗，姜新刚，吴瑞艳

1.乐泰药业有限公司医药研究院，黑龙江哈尔滨 150025；2.哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150076

酒精性肝病是由长期过量饮酒导致的肝脏损伤。初期常表现为脂肪肝，严重者表现为肝炎、肝纤维化和肝硬化[1]。主要发病机制是乙醇及其衍生物的代谢过程中直接或间接诱导的炎症反应，氧化应激、肠原性内毒素、炎性介质等多种因素相互作用的结果[2]。不觉晓口服液是由刺五加、首乌藤、柏子仁、远志提取而成，具有改善睡眠的功能。总黄酮是不觉晓口服液的主要有效成分，其每100 毫升含总黄酮5.7 g。现代药理研究表明[3-4]，黄酮类化合物具有扩张冠状血管、降血脂、抗抑郁、抗氧化等作用。黄酮类化合物还可以提高生物体抗氧化及清除自由基的能力，其抗氧化原理主要是黄酮类化合物酚羟基上的氢原子与过氧自由基结合生成黄酮自由基，进而与其他自由基反应，终止自由基链式反应，起到抗氧化的作用[5-7]。

一次性乙醇灌胃，是常用的氧化损伤模型制备方法，乙醇通过产生过量自由基的引起多器官损伤，导致氧化应激状态[8-9]。目前不觉晓口服液用于肝脏氧化损伤方面的研究报道较少，因此该文针对不觉晓口服液对乙醇氧化损伤的保护作用进行研究，以2020 年8—10 月期间选取100 只小鼠为研究对象，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品

不觉晓口服液（国食健字G20040683），人体推荐剂量为40 mL/d。

1.2 实验动物

清洁级健康ICR 小鼠（长春亿斯实验动物有限公司），体质量约18～22 g，实验动物使用许可证号：SCXK(吉)2018-0007。

1.3 仪器与试剂

多功能酶标仪（TECAN infinite F50）、低温高速离心机（Thermo Fisher Sorvail ST 8R）、电热恒温水浴锅（DZKW-4）、紫外分光光度计（岛津UV-1780）等仪器；谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）测试试剂盒、超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所、无水乙醇（优级纯GR）等试剂。

1.4 方法

依据国食药监保化[2012]107 号文件中，参考其中抗氧化功能评价方法。将小鼠随机分为5 组，分别为空白组、造模组及不觉晓口服液低、中、高3 个剂量组，20只组，每组雌雄各半。不觉晓口服液给药量以人体推荐剂量的5、10、30 倍设3.33、6.67、20.00 mL/（kg·bw）3 个剂量组，空白组和造模组按照10 mL/（kg·bw）给予等体积的蒸馏水，连续灌胃30 d，每隔6 d 称重调整灌胃量。末次灌胃后，空白组不禁食水，而造模组和不觉晓给药组禁食不禁水16 h，给予50%乙醇12 mL/（kg·bw）一次性灌胃，6 h 后眼球取血并取肝组织备用。

1.5 抗氧化指标测定

取每组小鼠血清和肝组织，血样3 000 r/min 离心10 min，取上清备用；肝组织匀浆后备用；测定抗氧化物质GSH、脂质氧化产物MDA、肝组织蛋白的含量和抗氧化酶SOD 活性。

1.6 统计方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据处理，计量数据以（）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠血清及肝组织中GSH 含量对比

该次实验中对模型鼠的血清和肝组织分别进行检测，GSH 含量的变化见图1、图2 和表1。不觉晓口服液灌胃30 d 后，造模组与空白组相比，GSH 含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），血清和肝组织变化一致，表明乙醇氧化损伤造模成功。不觉晓口服液诱导的GSH 含量的变化具有性别差异，雄性组给予不觉晓口服液低、中、高剂量组与造模组相比均有显著性变化,差异有统计学意义（P＜0.05）；雌性组血清中GSH 仅高剂量组有显著性影响，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝脏组织GSH 含量为中、高剂量组有显著性影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中GSH 的影响[(),μmol/L]

表1 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中GSH 的影响[(),μmol/L]

注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与造模组相比，*P＜0.05

图1 不觉晓口服液对雌雄小鼠血清抗氧化物质GSH 的影响

图2 不觉晓口服液对雌雄小鼠肝组织抗氧化物质GSH 的影响

2.2 小鼠血清及肝组织中SOD 活性对比

造模组血清和肝组织中的SOD 与空白组相比活性显著降低，乙醇影响了抗氧化酶SOD 的活性，造模成功。SOD 的含量变化见图3、图4 和表2。在血清和肝脏组织中，不觉晓口服液各剂量组与造模组相比较，SOD酶活性均有显著性提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 不觉晓口服液对雌雄小鼠血清抗氧化物质SOD 的影响

图4 不觉晓口服液对雌雄小鼠肝组织抗氧化物质SOD 的影响

表2 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中SOD 的影响[(),U/mgprot]

表2 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中SOD 的影响[(),U/mgprot]

注：#与空白对照组相比，P＜0.05；*表示与造模组相比，P＜0.05

2.3 小鼠血清及肝组织中MDA 含量对比

MDA 的含量变化见图5、图6 和表3。乙醇诱导氧化损伤，使体内过氧化物含量增加，造模组与空白组的比较，差异有统计学意义（P＜0.05），MDA 含量明显增加。给予不觉晓口服液后，与造模组相比，能够明显降低MDA 的含量，差异有统计学意义（P＜0.05），表明不觉晓口服液具有抗氧化的作用。

图5 不觉晓口服液对雌雄小鼠血清抗氧化物质MDA 的影响

图6 不觉晓口服液对雌雄小鼠肝组织抗氧化物质MDA 的影响

表3 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中MDA 的影响[(),nmol/mL]

表3 不觉晓口服液对小鼠血清和肝组织中MDA 的影响[(),nmol/mL]

注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与造模组相比，*P＜0.05

3 讨论

健康机体具有完整的抗氧化和抗炎防御体系，其中SOD 是主要的抗氧化酶，GSH 是主要的抗氧化物质。抗氧化系统发挥调节作用，清除自由基，减少过氧化物的产生，保护肝组织，减少氧化损伤[10]。当乙醇一次性灌胃，摄入量超过清除能力，脂质过氧化产物MDA 含量增加，损伤细胞膜的通透性，进而发生一系列生理生化反应，导致氧化损伤[11]。MDA 是脂质过氧化反应中的重要产物，是评价自由基产生和脂质过氧化发生的间接指标，其含量变化反映氧化损伤的程度[12]。GSH 作为抗氧化物质具有保护细胞免受氧化损伤的作用，同时具有解毒的作用，当GSH 含量减少甚至耗竭，说明机体受到氧化损伤，严重时可引起毒性作用，因此GSH 也是氧化损伤的重要指标[13-14]。抗氧化酶SOD 在正常生理状态下，发挥清除氧自由基的作用，含量减少说明机体清除氧自由基的能力减弱[15]。该实验通过乙醇造成氧化损伤模型，对比各组间血清和肝组织的GSH 含量、SOD 活力、MDA 含量，说明不觉晓口服液的抗氧化功能。

该实验中造模组与空白组相比，MDA 含量明显增加，GSH 和SOD 明显减少，说明乙醇造成小鼠血清和肝组织中的氧化产物增加而抗氧化能力降低，模型构建成功。该研究结果显示，雌性组血清中GSH 的含量高剂量组（64.47±0.78）μmol/L 显著高于造模组（60.83±1.35）μmol/L（P＜0.05）；雌性组肝脏组织中GSH 的含量中剂量组（3.32±0.18）μmol/L、高剂量组（4.20±0.34）μmol/L显著高于造模组（1.70±0.08）μmol/L（P＜0.05）。在血清和肝脏组织中，不觉晓口服液低、中、高剂量组与造模组相比，SOD 活性均有显著性提高（P＜0.05）；不觉晓口服液低、中、高剂量组与造模组相比，能够明显降低MDA的含量（P＜0.05）。低、中、高剂量与造模组相比较，可以使MDA 含量降低，GSH 和SOD 含量与造模组相比明显增加，且血清与肝组织的变化一致，说明不觉晓口服液可以对抗酒精对肝脏的损伤，具有护肝作用[15]。

解庆凡等[16]的研究表明：血清、肝组织中低、高剂量组SOD 活性分别为（189.03±16.84）U/ml、（102.53±11.38）U/mg、（201.23 ±15.63）U/mL、（110.29 ±12.42）U/mg，血清、肝组织低、高剂量组MDA 含量分别为（3.78±0.42）nmol/mL、（9.05±1.14）nmol/mg、（3.61±0.28）nmol/mL、（8.76±1.21）nmol/mg，脂脉宁高、低剂量组血清、肝组织中SOD 活性均高于造模组，MDA 含量均低于造模组(P＜0.05)。张可兰等[5]的研究表明：血清中三叶木通总黄酮低、中、高剂量组MDA、SOD、GSH-PX 分别为（6.50 ±0.48）nmol/mL、（6.37 ±0.90）nmol/mL、（6.19 ±0.90）nmol/mL、（160.64±19.32）U/mL、（189.49±18.15）U/mL、（195.14±17.38）U/mL、（197.62±18.96）U/mL、（231.43±27.15）U/mL、（234.67±22.56）U/mL，显著高于造模组MDA、SOD、GSH -PX（7.43 ±0.66）nmol/mL、（137.41 ±17.44）U/mL、（172.38±22.46）U/mL，各给药组大鼠血清MDA 含量显著降低，SOD、GSH-Px 活性显著升高(P＜0.05）。提示三叶木通总黄酮可能通过抗氧化作用保护肝损伤小鼠。董清清等[9]研究表明：肝组织中刺五加注射液低、中、高剂量组MDA 和GSH 的含量分别为（8.88 ±1.29）、（8.20 ±0.99）、（6.07 ±1.09）nmol/mgprot、（2.05 ±1.52）、（3.19 ±0.82）、（4.17 ±0.95）mg/gprot，显著高于模型组（10.04±1.63）nmol/mgprot、（1.73±0.89）mg/gprot，与造模组比较，低、中、高剂量MDA 含量明显降低(P＜0.05)，GSH 含量则增加(P＜0.05)。以上研究结果与该文研究结果相一致，该文中造模组中GSH、SOD 水平降低，而MDA 含量升高，说明小鼠摄入乙醇后体内出现氧化损伤，自由基增多，脂质过氧化物增多，SOD、GSH在抗氧化过程中损耗过多，处于低水平状态。而不觉晓口服液低中高剂量组与造模组相比，SOD、GSH 水平升高，MDA 含量降低。

不觉晓口服液处方由刺五加、首乌藤、柏子仁、远志组成，其中刺五加具有一定的清除自由基能力和抗自由基活性[17]；首乌藤具有显著的体内抗氧化活性[18]；柏子仁具有远志具有抗衰老作用，可提高机体抗氧化能力[19]，经过科学配伍后，可增强其抗氧化功效。不觉晓口服液中含有大量的总黄酮，黄酮类化合物具有清除自由基的作用[20]，且其浓度与清除活力成正相关。

综上所述，不觉晓口服液通过提高血清及肝脏中抗氧化指标的水平，清除自由基，减轻脂质过氧化反应，有效干预酒精对肝细胞的损伤，发挥其抗氧化和保护肝脏的作用，为保护肝脏类的药品提供科学依据。