牙周炎对非酒精性脂肪肝病影响的研究进展

王沙沙，刘向红，杜 芹

(1.川北医学院口腔医学系，四川 南充 637100；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072；3.四川省医学科学院·四川省人民医院东院，四川 成都 610072；4.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041)

自2010年以来，关于非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)和牙周病之间关系的流行病学研究开始引起世界各地许多研究小组的兴趣。2017年Iwasaki等[1]使用超声波检查1226 名成人，结果表明 NAFLD 的发病率随着牙周病严重程度的增加而增加。2018年Pessoa等[2]研究比较在一个或两个牙周结扎丝诱导的实验性牙周炎的大鼠的肝损伤，结果表明，一个或两个结扎丝诱导的牙周炎都足以引起脂肪肝。2019年Vasconcelos等[3]研究大鼠牙周炎对肝脏的影响，结果显示实验性牙周炎引起大鼠肝脏免疫组化、组织病理学、超微结构、氧化和生化变化。研究显示，牙周病与NAFLD的发病及进展之间呈正相关。

1 NAFLD与牙周炎的相关性

NAFLD现在被认为是全球范围内最常见的慢性肝病，是一种从非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的连续肝脏异常，其病程不同，但最终都可导致肝硬化和肝癌。NAFLD以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为临床特征，可引起不同程度的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，进展性NAFLD的主要组织学特征是纤维化[4]。牙周炎是一种口腔疾病，在世界范围内非常普遍，发达国家的人口患病率为30～50%，但只有约10%的人以严重形式存在。牙周炎除了对口腔健康造成损害外，还影响其他类型的疾病。大量研究证实了牙周炎与全身性疾病之间的关联，例如2 型糖尿病、心血管疾病、早产儿低出生体重。牙周炎的主要致病菌经证实是牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis，P.g)，而P.g感染是NAFLD病理进展的重要危险因素。越来越多的证据还表明，牙周炎可能参与肝脏疾病的进展，例如非酒精性脂肪肝，肝硬化和肝细胞癌，并影响肝移植。目前，牙周炎对系统性疾病产生影响有三种假设，一是局部牙周感染会导致全身炎症介质的增加[5]；二是在牙周炎患者中，菌血症可能起源于牙周袋，因为全身性慢性牙周炎患者在发炎的牙周袋中出现溃疡，而且溃疡的总面积大约与手掌一样大[6]； 三是由牙周病引起的口腔微生物组的改变可能会影响肠道微生物组改变[7]。尽管许多研究都支持了NAFLD与牙周病之间的关系，但是，牙周病对 NAFLD 和 NASH 临床发病机制的直接影响尚不完全清楚。

2 病因学

2.1 牙周致病微生物对NAFLD的影响长期以来，牙周病的微生物病因学一直是研究的焦点。目前，牙龈卟啉单胞菌P.g被广泛认为是牙周炎的主要致病菌。P.g是一种革兰氏阴性厌氧菌，是口腔微生物组的一个重要组成部分。P.g不仅对系统性疾病有影响，对肝脏也有负面影响。人类试验和动物实验已经证实了肝组织中存在P.g定植。在一项研究中评估P.g感染对进展期NASH的风险的影响，结果提示P.g感染是NAFLD病理进展的重要危险因素[8]。在一项动物研究，高脂饮食喂养的大鼠在P.g诱导的牙周炎，可加重了大鼠非酒精性脂肪性肝炎的进展，认为P.g及其内毒素在牙周炎与NASH的关系中起着关键作用[9]。P.g感染可能是NAFLD发展的一个独立的预测因子，并可能导致其他肝脏疾病的进展。目前发现可能通过三种途径[10]影响肝脏病变：①细菌通过血液循环定植肝脏细胞。Ishikawa等[11]用P.g感染小鼠口腔，在小鼠肝脏细胞中发现P.g的存在，且肝脏中的P.g为活细胞，能够被培养。Hisako等[12]在52.5 %的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis；NASH)患者肝组织内检测到P.g的存在，且P.g的检出与肝组织纤维化评分呈正相关。②P.g释放的内毒素和细胞因子通过血液循环进入肝脏引起免疫反应。Ding等[13]研究证明，P.g衍生的脂多糖通过激活NF-kB和JNK信号通路导致肝脏脂质过度积累。③Arimatsu等[14]发现P.g可以通过改变肠道微生物群，诱导与牙周炎相关的全身性疾病相关的各种炎症变化。Sasaki等[15]发现注射P.g内毒素可加重非酒精性脂肪肝，破坏葡萄糖/脂质代谢，改变小鼠肠道微生物群。

2.2 促炎介质在牙周炎影响NAFLD发生发展中的作用牙菌斑是由革兰氏阴性细菌细胞壁组成，主要由肽多糖、多糖、蛋白质、脂质、脂多糖(LPSs)和脂蛋白组成。在这些成分的刺激下，牙周组织产生炎症细胞因子(如IL1β、IL-12、IL-10、IL-6、TNF-α和INF-γ)和趋化因子[如单核细胞趋化蛋白5(MCP-5)、IL-8和巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、前列腺素E2和一氧化氮(NO)]。这些促炎细胞因子参与了肝脏疾病的进展，如肝硬化。口腔细菌在细胞因子网络中也很重要。由牙周致病菌菌，如：牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌，释放的LPS通过与Toll样受体(TLR-2/4)结合影响免疫系统，口腔细菌还通过与TLR4结合刺激共刺激分子、分化簇(CD)C0/CD86的表达；并可能参与T细胞的激活并加剧肝脏炎症[16，17]。Kupffer细胞是肝脏中表达最高水平的TLR4的折叠细胞，是肝脏炎症中对LPSs做出反应的主要细胞，以产生炎症细胞因子、趋化因子和活性氧(ROS)。在一项研究肿瘤药物实验中，栀子苷和绿原酸联合应用可通过抑制Kupffer细胞的激活，降低炎性因子的表达，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，从而改善小鼠NASH[18]。其他一些动物实验表明，LPSs诱导的TNF-α及其随后与TLR2信号的相互作用促进了小鼠的NASH进展[19]。

2.3 氧化应激氧化应激是ROS、活性氮(RNS)和自由基的产生和消除之间的不平衡，会造成DNA碎裂、脂质过氧化、和蛋白质氧化，导致膜完整性的丧失、蛋白质的结构和功能的变化以及基因突变。ROS和RNS被认为是引起细胞损伤的最重要的肝脏毒性机制。存在于牙菌斑中的细胞成分，招募并激活超反应多态核细胞，从而加速了ROS的产生过程。各种研究已经表明了牙周炎对循环ROS和氧化应激的影响。例如，硫巴比妥酸反应物质，如丙二醛(MDA)，一种通常用于脂质过氧化的生物标志物，在牙周炎患者中，血浆、红细胞和局部细胞均质中的水平系统升高[20]。与健康人群相比，在牙周炎患者的牙龈沟液(GCF)和唾液中也发现了MDA的升高。此外，MDA/4-羟基烯醛的GCF浓度比唾液浓度高200～400倍，这反映出GCF中的ROS活性大大高于唾液。在一项研究中，P.g生成的LPS刺激PDL成纤维细胞，结果表明，磷酸二核苷酸(NADPH)氧化酶4(NOX4)水平显著升高，并伴随着ROS和过氧化氢酶的显著升高[21]。在一项病例对照研究中，牙周炎患者血清中谷胱甘肽、过氧化氢酶和硒与健康对照组相比水平较低，差异显著[22]。此外，研究表明，牙周治疗可以改善慢性牙周炎患者的促氧化/抗氧化平衡。通过这些发现，人们认为牙周炎引起的ROS可能涉及肝损伤。

3 牙周病影响NAFLD可能存在的信号通路

3.1 NF-kB和JNK信号通路Ding等[13]研究证明，P.g衍生的脂多糖通过激活NF-kB和JNK信号通路导致肝脏脂质过度积累。与大肠杆菌LPS或未经LPS治疗的对照组相比，P.g-LPS刺激的人肝细胞细胞(HepG2)积累了更多的细胞内脂质。此外，P.g-LPS刺激显著上调了MyD88和促炎细胞因子，并增加了HepG2细胞中p65和JNK的磷酸化。抑制p65和JNK的磷酸化，则减少了P.g-LPS刺激时的脂质积累，这表明P.g-LPS可能通过激活NF-kB和JNK信号通路导致HepG2细胞的细胞内脂质积累和炎症。

3.2 Th17 轴近年来，NAFLD 和 Th17之间的联系引起了关注。Th17 细胞是 T 辅助细胞的一个已定义的亚群，主要分泌IL-17A[23]。IL-17A在免疫细胞和非免疫细胞中诱导许多促炎症细胞因子，如 IL-6、粒细胞集落刺激因子和 TNF-a，在其他活动中，它会导致先天免疫细胞的激活，促炎症信号通路和中性粒细胞的招募。因此，IL-17A是起到抗感染保护作用的一个重要因素。在NAFLD动物模型的肝脏和外周血中大量存在Th17细胞。小鼠实验研究表明，牙周组织中 Th17 细胞的积累依赖于口腔细菌；在人类研究中，在牙周病患者的牙龈组织中产生 IL-17A的细胞比在健康的牙龈组织中更丰富，导致产生 IL-17A的细胞浸润和牙周病组织的炎症[24]。另一项报告称，同时缺乏 IL-17A和 IL-17F 的小鼠不仅可以抑制牙周病相关的骨破坏，而且可以增加牙周组织中细菌的数量[25]，口腔原有菌群也发生变化。事实上，Th17 相关的细胞因子有助于维持肠道菌群和抗菌肽的分泌，并可能在口腔固有细菌中发挥类似的作用。

3.3 HMGB1-TLRS通路高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupboxehromosomalprotein1，HMGB1)

这是一种广泛存在于真核细胞中的非组蛋白核蛋白，参与DNA的复制、转录、修复以及细胞运动等。HMGB1也是一种炎性细胞因子，由损伤坏死的细胞被动释放，或在内毒素、IL-1和TNF等的刺激下，由巨噬细胞、单核细胞活化后主动分泌。HMGB1的正调节信号转导通路主要有HMGB1-RAGE通路和HMGB1-TLRs(Toll样受体)通路，并进一步介导炎症发生。Hisato等[12]发现，在NASH中，TLR2显著性升高，促进肝脏炎性进程。到目前为止，已经发现了13个TLRs的成员。其中，HMGB1可以与TLR2、TLR4和TLR9相互作用[26，27]。HMGB1通过这三个TLRs发出信号，并激活骨髓样分化因子88-(MyD88-)依赖通路，以激活NF-kB和干扰素调节因子(IRF)途径[28]。另一项研究[29]为了证实丙酮酸乙酯(EP)，一种HMGB1释放/表达的抑制剂，对调节糖尿病肝脏中HMGB1/TLR4炎症级联激活的影响，结果观察到，EP导致HMGB1表达降低，降低了HMGB1/TLR4通路的促炎活性，并对糖尿病肝脏发挥保护作用，改善了肝脏组织学、抗氧化和炎症状态。因此，HMGB1/TLR4信号通路与糖尿病引起的炎症和随后的肝损伤有关。

综上，目前NAFLD进展的危险因素尚未完全阐明，许多因素与NAFLD的发病机制有关，包括肥胖、糖尿病、血脂异常和高血压。牙龈卟啉单胞菌(P.g)被认为是系统性疾病的一个混杂危险因素。然而，目前尚不清楚代谢因素可能如何影响NAFLD的发病机制和进展。一些证据表明，氧化应激的增加和几种因子的变化，包括脂肪因子、趋化因子和促或抗炎细胞因子，主要参与了NAFLD到NASH的进展。巨噬细胞/库普弗细胞在氧化应激、胰岛素抵抗和NAFLD的发病机制中起着核心作用。多年来，有力的证据试图证明NAFLD、TD2M、胰岛素抵抗、肥胖、牙周炎和其他代谢综合征之间的关联。然而，这是一个广阔而复杂的领域，到目前为止，还没有明确的证据表明葡萄糖代谢、糖尿病胰岛素抵抗和NAFLD的表现之间的联系。