儿童EB病毒感染非肿瘤性疾病与病毒潜伏期膜蛋白基因多态性的相关性研究

史利欢，陈 静，谢 昕，刘 炜

(河南省儿童医院·郑州儿童医院，河南省小儿血液医学重点实验室，河南 郑州 450000)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种多发于儿童的疱疹病毒科γ亚科DNA病毒，主要通过感染人B淋巴细胞，引起免疫功能紊乱而发病，还可以长期潜伏在体内，通过影响多种潜伏基因表达，引起全身各系统和器官疾病[1]。研究显示，儿童EBV感染可以诱发严重的免疫功能紊乱，引起一系列的免疫病理损伤，包括传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)[2]、EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(EBV-associatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV-HLH)[3]、慢性活动性EBV感染(Chronic active EBV，CAEBV)[4]等，少部分甚至可发展为恶性肿瘤。IM是EBV感染引起的一种良性免疫病理性疾病，大部分患者均预后良好，而EBV-HLH和CAEBV病情相对较为严重，预后相对较差，甚至可以危及患者生命[5，6]。目前有关IM、EBV-HLH及CAEBV等EBV感染相关非肿瘤性疾病的发病机制尚未阐明，分析疾病发生和进展的机制，指导临床治疗具有重要意义。EBV 潜伏膜蛋白(latent membrane protein 1，LMP1)是EBV潜伏感染主要的基因表达产物，不仅可以参与EBV感染相关肿瘤的发生，还可以影响机体的免疫功能，参与IM、EBV-HLH等多种EBV感染相关非肿瘤性疾病的发生[7]。既往研究分析了LMP1基因变异与儿童EB病毒感染相关肿瘤性疾病的关系[8]，但LMP1基因多态性与儿童EBV感染相关非肿瘤性疾病之间的关系尚不清楚。本研究检测了儿童EBV感染相关非肿瘤性疾病的LMP1基因多态性，并分析了其基因多态性与疾病发生和进展之间的关系，旨在为EBV感染患儿的防治提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年12月至2020年12月在郑州儿童医院确诊的94例EBV感染相关非肿瘤性疾病患儿，纳入标准：均符合2016年中华医学会制定的《儿童主要非肿瘤性EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则建议》中EBV感染相关非肿瘤性疾病的诊断标准[9]，所有患儿均在症状发作48 h内入院检查；EBV抗体检测均为阳性，且均获得了患儿家属的知情同意。排除标准：EB病毒感染相关肿瘤性疾病；存在贫血、出血及其它血液系统疾病者；存在自身免疫性疾病和恶性肿瘤等者。94例EBV患儿中男63例，女31例，年龄1～12岁[(6.08±2.03)岁]，其中IM患儿40例，EBV-HLH患儿30例，CAEBV患儿24例。随机选取同期携带EBV病毒的无症状儿童94例为对照组，所有患儿均在健康体检时经血常规检测发现中性细胞降低，淋巴细胞偏高，并经EBV抗体检测为阳性，同时排除存在既往EBV感染症状患儿。男61例，女33例，年龄1～12岁[(5.83±1.93)岁]。两组患儿的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经郑州儿童医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法①临床症状：记录EBV感染相关非肿瘤性疾病患儿入院时的临床症状。②免疫球蛋白水平检测：入院第2 d，采集患儿空腹血液2 ml，离心(3000 rpm，10 min)，取血清，采用日立7600全自动生化分析仪检测血清中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、IgA、IgM、IgE、补体3(complement，C3)和C4水平。③外周血淋巴细胞EBV病毒载量和LMP1表达水平：入院第2 d，采集所有EBV感染患儿的静脉血2 ml，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，提取PBMC细胞的DNA，采用EBV检测试剂盒(上海谷研实业有限公司)进行RT-PCR反应，检测EBV DNA载量，严格按照说明书进行操作。入组第2 d，采用RT-PCR检测LMP1 mRNA水平，上游引物：5’-CTAGGAAGAAGGCCAAAA-3’，下游引物：5’-AACGCAGTCTTAGGTATC-3’。Western blot方法检测PBMC中LMP1蛋白表达水平。④EBV患儿LMP1基因多态性检测：入组第2 d，参考已有文献[10]，采用巢式PCR扩增LMP1基因，引物序列见表1，采用末端终止法对PCR扩增产物进行双向测序，以EBV标准株B95-8序列作为参比进行分析。

表1 LMP1基因扩增和测序引物

1.3 统计学方法应用SPSS 22.0软件分析所得实验数据。满足正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较多组间差异性，SNK-q比较多组两两组间的差异；计数资料采用例(率)表示，采用χ2检验分析比较；采用Pearson相关性分析LMP1基因多态性与EBV DNA载量、LMP1表达和免疫球蛋白水平变化之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的临床表现EBV-HLH组患儿脾肿大和肝肿大的发生率明显高于IM组，咽峡炎、淋巴结肿大和眼睑水肿的发生率明显低于IM组(P<0.05)；CAEBV组脾肿大和肝肿大的发生率明显高于IM组，咽峡炎和眼睑水肿的发生率明显低于IM组，淋巴结肿大的发生率明显高于EBV-HLH组(P<0.05)。见表2。

表2 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的临床表现比较 [n(%)]

2.2 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的血清免疫球蛋白水平变化各组患儿免疫球蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的血清免疫球蛋白水平变化 (g/L)

2.3 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的血LMP1表达水平各组患儿EBV-DNA载量和LMP1表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的血LMP1表达水平

2.4 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的LMP1基因变异类型EBV-HLH组患儿LMP1基因XhoⅠ位点(-)和del-LMP1的发生率明显高于IM组和对照组(P<0.05)；CAEBV组LMP1基因XhoⅠ位点(-)和del-LMP1的发生率与EBV-HLH组、IM组和对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的LMP1基因变异类型 [n(%)]

2.5 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的LMP1基因变异与EBV-DNA病毒载量之间的关系采用变量赋值，XhoⅠ位点(+)=0，XhoⅠ位点(-)=1；wt-LMP1=0，del-LMP1=1。EBV感染相关非肿瘤疾病患儿LMP1基因XhoⅠ位点(-)变异和del-LMP1位点变异与EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈显著正相关关系(P<0.05)。见表6。

表6 EBV感染相关非肿瘤疾病患儿的LMP1基因变异与EBV-DNA病毒载量之间的关系

3 讨论

EBV是儿科临床常见的一种双链DNA病毒感染性疾病，主要通过感染人B淋巴细胞，引起一系列的免疫病理损伤[11]。既往已有多项研究分析了EBV感染相关肿瘤性疾病的临床特征和LMP1基因变异情况，但对EBV感染相关非肿瘤性疾病的关注较少[12，13]。本研究分析了几种常见EBV感染相关非肿瘤性疾病IM、EBV-HLH和CAEBV的临床表现，发现EBV-HLH和CAEBV患儿肝脾肿大的发生率高于IM患儿，咽峡炎、淋巴结肿大和眼睑水肿的发生率低于IM患儿。研究显示[14]，IM 患儿最常见的临床表现是发热、咽峡炎、淋巴结肿大等，CAEBV患儿临床主要表现为慢性的或反复出现的IM样症状，随病情发展可导致HLH，引起多组织器官功能损伤，危及患儿生命[15]。结合本研究结果表明，随着IM病情进展，疾病可发展为CAEBV，甚至EBV-HLH，临床症状逐渐加重，提示临床可根据EBV感染患儿的临床表现和症状严重程度，评估疾病进展，指导临床治疗。本研究中，随着IM向CAEBV 和EBV-HLH组进展，血清IgG、IgA、C3和C4水平明显降低。已有多项研究显示，EBV感染可引起患者免疫功能下降，其中IM 组患儿血清免疫球蛋白水平变化不明显，EBV-HLH 患儿免疫球蛋白水平出现明显下降[16，17]，本研究结果与其基本类似，提示随着病情进展，机体免疫功能下降。

本研究中，随着IM向CAEBV 和EBV-HLH组进展，患儿EBV-DNA载量和LMP1表达水平明显升高。LMP1基因是公认的EBV致癌基因，近年来研究显示，LMP1可以通过诱导核因子κB信号通路活化，调节多种免疫炎症介质释放，参与IM的疾病进展[18]，提示LMP1与EBV感染的病情进展有关，临床可根据患儿血清LMP1水平，评估疾病进展，指导临床个体化治疗方案的进行。本研究中，EBV-HLH组患儿LMP1基因XhoⅠ位点(-)和Del-LMP1的发生率明显高于IM组和对照组，说明LMP1基因多态性与EBV感染进展有关。LMP1基因位于在EBV标准株B95-8中的nt169474-168193 之间，编码含 386 个氨基酸(amino acid，aa)的跨膜蛋白LMP1。XhoI(-)变异是指LMP1 基因N 端第 17 位氨基酸出现核苷酸t→g突变，导致XhoI酶切位点丢失，del-LMP1变异是指C端胞浆区(aa187～386)出现30 bp缺失(aa343-352 GGGHSHDSGH)[19]。Wang等[20]研究显示，XhoI(-)和del-LMP1变异与EBV感染相关淋巴瘤的发生有关。本研究中，EBV感染相关非肿瘤疾病患儿LMP1基因XhoⅠ位点(-)变异和del-LMP1位点变异与EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈显著正相关关系，说明XhoI(-)和del-LMP1变异可能通过影响EBV感染相关蛋白LMP1表达，推进疾病进展。

综上所述，EBV-HLH患儿的免疫功能明显低于CAEBV患儿，低于IM患儿，EBV-DNA载量和LMP1表达水平明显高于CAEBV患儿，高于IM患儿，且EBV感染相关非肿瘤疾病患儿LMP1基因XhoⅠ位点(-)变异和del-LMP1位点变异与EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈显著正相关关系，临床可根据EBV患儿LMP1基因多态性和血清中水平变化，指导临床治疗工作的进行。

本研究不足之处在于样本数量较少，且本研究主要探讨了EBV感染相关非肿瘤疾病患儿LMP1基因多态性变化，但基因多态性影响EBV感染进展的具体机制尚不明确，需进一步研究探索。