外周血CD14+单核细胞Toll样受体2表达在肝硬化并发感染患者的诊断价值

范潇月，刘飞飞，陈琳琳

(四川省德阳市人民医院，四川 德阳 618000)

细菌感染是肝硬化患者严重的并发症之一，也是重症肝病患者重要的致死原因之一，细菌感染的发生会促进肝硬化患者疾病进展，诱发失代偿、脓毒血症、肝衰竭等，增加患者死亡风险[1]。因此，及时诊断感染的存在，对于肝硬化患者的临床治疗以及预后意义重大。肝硬化患者感染早期，因病原体“扳机”效应，继发肝硬化免疫损伤，导致细胞大量坏死，释放降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，而上述促炎因子进一步通过“瀑布效应”诱发全身炎症反应，致使机体呈免疫抑制状态，进一步增加继发感染机会[2]。有学者研究发现外周血免疫球蛋白、补体水平与患者的感染有关[3]。Toll样受体(TLR)是近年来发现的在宿主免疫应答中起重要作用的细胞表面受体分子，其中TLR-2是目前了解较多的受体，且与免疫功能关系最为密切[4]。CD14是单核细胞以及巨噬细胞的特征性标记，与细菌感染关系密切[5]。目前国内关于外周血循环因子与肝硬化并发感染的研究报道并不多见，之间的相关性仍不清楚。本研究通过分析检测外周血CD14、TLR2的表达以及PCT、TNF-α水平的变化，旨在分析其免疫指标与感染及其预后的相关性，进一步明确外周血CD14+单核细胞TLR2表达的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年8月至2020年10月我院诊治的104例肝硬化患者为研究组。纳入标准：①根据患者病史、临床表现、实验室以及影像学检查确诊为肝硬化，并符合肝硬化诊断标准[6]；②患者临床资料完整。排除标准：合并恶性肿瘤、心肺肾功能障碍、肝移植患者。选择同期我院健康体检者96例为对照组。研究组男77例，女27例；年龄32～69岁[(51.05±9.62)岁]。对照组男71例，女25例；年龄30～70岁[(52.09±8.85)岁]。根据患者是否发生感染将研究组分为感染组45例和未感染组59例，感染组男34例，女11例；年龄32～65岁[(51.34±9.43)岁]；肝硬化类型：乙型肝炎21例，丙型肝炎4例，酒精性18例，原因不明型2例；肝功能分级(Child-Pugh分级法)：A级25例，B级14例，C级6例。未感染组男43例，女16例；年龄33～69岁[(50.83±9.74)岁]；肝硬化类型：乙型肝炎27例，丙型肝炎6例，酒精性23例，原因不明型3例；肝功能分级：A级33例，B级18例，C级8例。研究组和对照组、感染组和未感染组一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2 方法①外周血CD14、TLR2表达检测：采集患者外周静脉血2 ml，取肝素抗凝全血100 μl，加入10 μl单克隆抗体藻红蛋白标记的抗人CD14、TLR-2抗体，充分振荡混匀，室温下避光孵育15 min，然后加入溶血素继续孵育10 min，离心分离并弃上清液，加入0.3 ml的PBS混匀，于4 ℃下孵育1 h。然后采用流式细胞仪检测外周血CD14、TLR2表达水平，并用平均荧光强度的几何均数(GMF)表达其含量。②感染指标检测：采用酶联免疫吸附法检测PCT、TNF-α水平。

1.3 观察指标①比较感染组、未感染组及对照组外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平。②分析外周血CD14、TLR2表达水平与PCT和TNF-α的相关性。③分析外周血CD14、TLR2表达水平对肝硬化感染的预测价值。④采用Child-Turcotte Pugh(CTP)评分评估患者预后，其分值低于7分表示预后良好，7分及以上表示预后不良，根据预后情况将感染组患者分为预后良好组和预后不良组，比较外周血CD14、TLR2表达水平，并分析其对预后的预测价值。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pereson相关分析；诊断及预测价值分析采用受试者工作曲线(ROC)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平比较感染组外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平均高于未感染组及对照组(P<0.05)。见表1。

表1 三组外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平比较

2.2 外周血CD14、TLR2表达水平与PCT和TNF-α的相关性外周血CD14、TLR2均与PCT、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 外周血CD14、TLR2表达水平与PCT和TNF-α的相关性

2.3 外周血CD14、TLR2表达水平对肝硬化感染的预测价值外周血CD14诊断肝硬化感染的曲线下面积(AUC)为0.724，敏感度为62.22%，特异度为96.61%，诊断阈值为>304.86；TLR2诊断肝硬化感染的AUC为0.903，敏感度为82.22%，特异度为93.22%，诊断阈值为>36.89；两者联合的AUC为0.953，显著高于单一诊断(P<0.05)。见图1。

图1 外周血CD14、TLR2表达诊断肝硬化感染的ROC曲线

2.4 不同预后患者外周血CD14、TLR2表达水平

预后良好组外周血CD14、TLR2表达水平显著低于预后不良组，外周血CD14预测预后的AUC为0.743，敏感度为66.67%，特异度为81.48%，预测阈值为>311.43；外周血TLR2预测预后的AUC为0.900，敏感度为88.89%，特异度为85.19%，预测阈值为>42.55；两者联合的AUC为0.936，显著高于单一诊断(P<0.05)。见表3和图2。

表3 不同预后患者外周血CD14、TLR2表达水平

图2 外周血CD14、TLR2表达水平预测肝硬化感染预后的ROC曲线

3 讨论

肝硬化患者易合并细菌感染，多以自发性腹膜炎、肺部感染为主，有学者针对肝硬化并发患者的细菌感染种类进行分析，发现具体细菌分布中以肺炎克雷伯杆菌为主，其次为大肠杆菌、金黄色葡萄杆菌、草绿色链球菌[7]。肝硬化患者受疾病因素影响，机体长期处于免疫功能抑制状态，因此肝硬化并发感染时免疫功能变化可能与非肝硬化患者不一致，感染引发的全身炎症反应不仅会加重患者肝功能损伤，还会并发全身多脏器衰竭，增加患者死亡风险。PCT作为感染标志物，既往研究发现PCT对于肝硬化并发感染具有较好的诊断价值[8]，但该指标的检测性能是未知的，没有临床验证的、可重现的临界值，无法准确诊断或排除感染，因此仍需进一步探索诊断价值更高的临床检测指标。

TLRs是近年来发现的一类病原模式识别受体，在机体的免疫反应中，尤其是调节巨噬细胞特异性识别病原、分泌促炎因子中具有重要作用，同时可调控诱导机体的适应性免疫反应，被认为是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障[9]。TLRs成员有10个，其中TLR2研究较多，该受体主要识别革兰氏阳性菌的信号转导，具有广泛的配体特异性，可协助TLR4参与人体内对脂多糖的反应[10]。CD14也是天然免疫中重要的模式识别分子，可与TLR2共同介导G+细菌成分与细胞的反应。既往已有部分研究表明肝硬化并发感染患者外周血CD14+、单核细胞TLR2表达水平存在异常变化[11，12]。本研究结果也显示感染组患者外周血CD14、TLR2表达水平均显著高于未感染组以及对照组患者，提示外周血CD14、TLR2表达水平与肝硬化患者感染的发生密切相关，与既往研究结果一致。PCT是一种细菌感染后刺激细胞释放的蛋白质，在正常人体内水平较低，但当出现细菌或真菌感染时，血液中PCT水平可急剧上升，被认为是较好的急性感染参数[13]；TNF-α的水平升高多是由细菌内毒素对机体的刺激引起的，其高水平可刺激相关炎症因子的产生，从而引发机体炎症反应[14]。故本研究以PCT、TNF-α为感染标志物，进一步分析外周血CD14、TLR2与感染的相关性，结果显示感染组患者PCT和TNF-α水平均显著高于未感染组以及对照组患者，且外周血CD14、TLR2均分别于PCT、TNF-α水平呈正相关，提示外周血CD14、TLR2表达水平的异常变化与肝硬化患者炎症状态密切相关，且对于感染诊断具有较高的临床预测价值，可作为肝硬化患者临床监测指标。肝硬化患者因肝功能严重受损、免疫功能降低，易并发各种感染，而在感染期间通过趋化因子、白三烯等重要调节性因子、TLRs表达等引起中性粒细胞功能受损，随着感染的进展，中性粒细胞基因表达发生变化，从而引起抑炎反应和免疫调节基因抑制[15]，故表现为随着PCT、TNF-α水平的升高，外周血CD14、TLR2表达水平也随之升高。本研究的创新点在于不仅对外周血CD14、TLR2表达水平的诊断价值进行分析，还深入分析了该指标对肝硬化并发感染患者预后的预测价值，结果提示外周血CD14、TLR2表达水平的异常变化与患者疾病变化密切相关，可较好预测预后。

综上所述，外周血CD14、TLR2表达水平对肝硬化并发感染患者具有较高的诊断以及预后预测价值，与机体炎症反应状态密切相关，可作为临床治疗预后评估指标。但本研究仍存在不足之处，受病例数限制，未针对肝硬化患者感染程度以及感染类型深入分析，且为单中心小样本研究，研究结果仍不具备普遍性，还有待于后续进一步论证结果。