神经生长因子、酪氨酸激酶及B7-H4与宫颈癌病情进展、预后的关系研究

刘海龙，李 娟，蒲雪峰，龙树林，滕 芸

(四川省岳池县人民医院妇产科，四川 广安 638300)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，且近年来该病的发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势[1]。相关研究表示，宫颈癌尽早干预患者预后较好，故寻找有效的分子标记物用来评价宫颈癌患者预后有重要意义[2]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族成员之一，可与靶细胞受体结合，经过不同的信号传导途径调节细胞的增殖、存活和凋亡等生物学作用[3]。而酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)是NGF的其中一类受体，相关研究表示，当NGF与TrkA结合可促进血管内皮生长因子表达，进而促进肿瘤血管生成，考虑与肿瘤进展密切相关[4]。此外，B7-H4作为B7家族新发现的成员，研究表示其可抑制T细胞增殖及细胞周期进展调控T细胞免疫应答，被临床认为对早期宫颈癌具有诊断价值；然而其表达与宫颈癌患者各项临床指标及预后的关系尚不明确[5]。本研究就宫颈癌NGF、TrkA及B7-H4的表达情况及与病理特征、预后的关系进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集我院病理科于2016年6月至2018年6月经术后病理确诊为宫颈癌的109例患者临床资料，纳入标准：①所有患者有明确的病理学诊断依据，均确诊为宫颈癌；②入组前未接受放疗及化疗；③临床资料完整且真实；排除标准：①合并血液疾病者；②严重精神疾患或痴呆等无法配合本研究者；③合并其他原发性恶性肿瘤者；④中途退出研究者。年龄20～60岁[(35.71±3.82)岁]。收集肿瘤组织及肿瘤旁的正常宫颈黏膜组织，分别作为癌组织组(n=109)和癌旁正常组织组(n=109)。本研究均经本院伦理委员会批准，患者均签署相关知情同意。

1.2 NGF、TrkA及B7-H4水平检测方法

1.2.1仪器与试剂 SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、免疫组织化学二抗试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS)(北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)、兔抗人B7-H4抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、兔单克隆NGF抗体(美国 Abcam公司)、兔单克隆TrkA抗体(美国Abcam公司)。

1.2.2检测方法 采集所有研究对象宫颈癌组织及癌旁组织，使用生理盐水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80 ℃恒温箱，分为三份。NGF、TrkA及B7-H4水平的检测采用免疫组织化学方法进行：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)[6]，石蜡切片标本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脱蜡，浸泡3次。3次离子水中浸泡抗原修复切片，磷酸盐缓冲液(PBST)洗3次。内源性过氧化物酶阻断剂滴加，室温孵育15 min，冲洗。一抗滴加，室温孵育1 h，冲洗。辣根酶标羊抗小鼠/兔 IgG聚合物滴加，室温孵育30 min。对照组采用磷酸盐缓冲液(PBS) 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗(eBioscience)室温孵育 30 min。二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，树胶封片。

1.3 结果判断判断NGF、TrkA及B7-H4蛋白范围的标准：每张切片在镜下分别以低倍镜及高倍镜进行观察，对每张切片上中下及里外中9个位置进行观察，最后对2位专家判断结果进行比对(差异较大时，需重新同时共同读片确定)。采用Volm双评分法[7]进行判定，在染色均匀的肿瘤区，选取5个高倍镜视野(×400)，按阳性细胞百分率(A值)评分：<25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分；按染色强度(B值)评分：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果[8]：阴性(-)：0分，弱阳性(+)：1～2分，中度阳性(++)：3～4分，强阳性(+++)：5～6分；两种计分的乘积为每例的加权分数，加权分数为0为阴性，其余均为阳性。

1.4 随访所有患者治疗结束后通过电话、微信、到院复诊等方式进行随访2年，随访截止日期为2020年6月30日。

1.5 统计学方法本研究数据均采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料以n(%)表示，采用t检验，计量资料以均数±标准差描述，行χ2检验；采用多元Logistic回归分析影响宫颈癌患者预后生存的危险因素；采用ROC分析NGF、TrkA及B7-H4对宫颈癌患者预后生存的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组NGF、TrkA及B7-H4的表达情况比较宫颈癌组织中NGF、TrkA及B7-H4阳性表达率显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组NGF、TrkA及B7-H4的表达情况比较 [n(%)]

图1 宫颈癌组织免疫组化染色图(×500) A：NGF阳性表达；B：NGF阴性表达；C：TrkA阳性表达；D：TrkA阴性表达；E：B7-H4阳性表达；F：B7-H4阴性表达

2.2 NGF、TrkA及B7-H4与宫颈癌患者不同病理参数的比较有淋巴结转移、FIGO分期处于Ⅱa期、宫颈间质浸润深度>1/2 mm、组织分化为G2、G3的患者NGF、TrkA及B7-H4阳性表达率显著高于无淋巴结转移、FIGO分期处于Ⅰb期、宫颈间质浸润深度≤1/2 mm、组织分化为G1的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 NGF、TrkA及B7-H4与宫颈癌患者不同病理参数的比较

2.3 宫颈癌患者预后情况109例患者经两年随访后显示，患者2年生存率为59.63%(65/109)。

2.4 影响宫颈癌患者预后生存的单因素分析表3显示，不同FIGO分期、分化程度、淋巴转移、宫颈间质浸润深度、肿瘤直径、NGF、TrkA及B7-H4的宫颈癌患者生存率比较差异无统计学意义(P<0.05)；而不同年龄、宫旁浸润患者的生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 影响宫颈癌患者预后生存的单因素分析

2.5 影响宫颈癌患者预后生存的多因素分析表4显示，FIGO分期、分化程度、淋巴转移、宫颈间质浸润深度、NGF、TrkA及B7-H4是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)。

表4 影响宫颈癌患者预后生存的多因素分析

2.6 NGF、TrkA及B7-H4对宫颈癌患者预后生存的预测价值采用ROC曲线分析 NGF、TrkA及B7-H4及三者联合对宫颈癌患者预后生存的预测价值，NGF、TrkA及B7-H4及三者联合曲线下面积分别为0.761、0.733、0738、0.853，各指标曲线下面积以联合检测最大。见表5、见图2。

表5 NGF、TrkA及B7-H4对宫颈癌患者预后生存的预测价值

图2 NGF、TrkA及B7-H4对宫颈癌患者预后生存的预测价值

3 讨论

近年来我国宫颈癌发病率逐年上升，尽管目前宫颈癌的外科手术已取得长足的进步，但术后复发转移及死亡的风险仍较高[9]。本研究显示，109例宫颈癌患者死亡率为40.36%，基本与既往研究相似，故寻求有效治疗靶点对降低宫颈癌患者死亡率有重要意义。

NGF是一种多功能、多肽性的物质，通过与靶细胞表面上的神经生长因子受体结合，介导发生生物学效应[10]。NGF一方面可作为丝裂原促进肿瘤分离、增殖；另一方面还可以通过自分泌和旁分泌作用促进骨髓瘤、纤维肉瘤、胃癌等多种恶性肿瘤细胞的血管新生及神经周围浸润[11，12]。而TrkA是trkA原癌基因编码的产物，对 NGF亲和力高，具有内在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受体[13]。研究发现，当TrkA与NGF结合，可形成跨膜氨基酸激酶gp140 Trk 组成二聚体，催化酪氨酸残基磷酸化，增强酪氨酸激酶活性；同时，在ras原癌基因的协助下，使信号向细胞内传导，激活RAS-MAPK通路，影响基因翻译、转录，进而调控细胞生长；影响恶性肿瘤细胞增殖、侵袭及转移[14]。此外，B7-H4是B7家族近年来研究较广泛的共刺激分子，通过抑制T淋巴细胞增殖，控制细胞周期，降低细胞因子产生发挥负性调节T细胞免疫应答作用，对机体内环境维持具有重要意义[15]。Lin[16]表示B7-H4分子异常表达可使机体对肿瘤免疫监视发展为免疫耐受，引发肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤进展。目前已在前列腺癌、宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤证实关系密切[17]。而本研究显示宫颈胃癌组织组NGF、TrkA及B7-H4阳性表达率显著高于癌旁正常组织组，且与FIGO分期、淋巴结转移及分化程度有关，与既往Faulkner[18]等学者对宫颈癌中研究一致，说明NGF、TrkA及B7-H4在宫颈癌患者中恶变程度、侵袭转移中占有重要作用。

同时，为明确影响宫颈癌患者预后影响的危险因素，研究对宫颈癌患者进行为期2年随访发现，患者死亡率为40.36%。相关研究发现，B7-H4与宫颈癌细胞胞增殖和凋亡、细胞周期调节、信号传导有关蛋白相互作用在肿瘤发生发展过程发挥作用，其水平与宫颈癌患者3年生存率密切相关[19]。而相关国外研究也曾表示，NGF表达水平可作为宫颈癌患者疾病程度与预后的生物学标志[20]。本研究予以Logistic回归分析中显示，FIGO分期、分化程度、淋巴转移、浸润深度、NGF、TrkA及B7-H4是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)。与上述研究一致，有力证明了NGF、TrkA及B7-H4与宫颈癌患者关系密切。此外，本文为深入了解NGF、TrkA及B7-H4与宫颈癌患者预后生存的价值，本研究采用ROC曲线研究显示，三者水平联合检测最大，进一步证实NGF、TrkA及B7-H4与宫颈癌患者预后死亡的重要指标；考虑与NGF、TrkA及B7-H4通过参与肿瘤细胞的分化、浸润和转移影响宫颈癌患者临床结局。但本研究由于纳入的样本量有限，研究结果有待通过进一步扩大样本量或多中心合作研究予以证实。

综上所述，NGF、TrkA及B7-H4在宫颈癌组织中呈异常表达状态；其表达水平与患者的肿瘤临床病理特征及预后有关，可作为预测宫颈癌患者预后的分子标志物和潜在的治疗靶点。