PM2.5暴露后激活核转录因子/环氧化酶2/前列腺素E2信号通路引起氧化应激损伤雄性生殖功能的机制研究

刘津念，郑 剑，殷永健，张正红，盛 夏，唐 伟

(1.重庆市巴南区第二人民医院泌尿外科，重庆 400054；2.重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆 400016)

不育是威胁人类生殖健康的全球性难题[1，2]。以大气颗粒物(PM)为特征的大气复合污染物暴露对健康有直接或间接影响，尤其是对生殖系统的影响也开始受到人们关注[3]。研究表明[4]，大气细颗粒物(PM2.5)对男性生殖系统有严重深远影响。前列腺素E2(PGE2)为花生四烯酸经环加氧酶催化的代谢产物，是重要炎症因子，COX-2为PGE2生成的主要限速酶，核转录因子κB(NF-κB)信号通路则是体内一条非常经典信号通路，在细胞凋亡过程中发挥重要作用[5，6]，研究发现[7]，NF-κB/COX-2/PGE2与男性生殖功能受损有关。本研究探讨PM2.5暴露后激活NF-κB/COX-2/PGE2信号通路引起氧化应激损伤雄性生殖功能的机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2019年11月至2020年11月于重庆医科大学实验动物中心、重庆医科大学生命科学院开展实验。选取20只清洁级别c57bl雄性小鼠，体重34～37 g[(35.48±1.27)g]。均于单笼饲养在18～21 ℃、湿度45%～60%环境中，实验期间饲喂普通清洁级饲料，自由摄食饮水，在适应性饲养1周后开展实验。主要试剂：DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(北京民海生物科技有限公司)；1∶250胰蛋白酶(北京聚合美公司)；胶原酶Ⅰ(Sigma公司)；考马斯亮蓝G250(Solarbio公司)；ELISA快速检测试剂盒(Meimian公司)；AxyPrep总RNA小量提取试剂盒(Axygen公司)；RNase-free Water(北京TransGen Biotech公司)；兔抗NF-κB多克隆抗体(英国Abcam公司)；兔抗COX-2单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；兔抗PGE2单克隆抗体(英国Abcam公司)；兔抗β-actin多克隆抗体(美国Proteintech公司)。仪器：小动物手术器械及溶液配制容器、电子天平、超净工作台、CO2培养箱、恒温水浴、离心机，均购自美国Thermo公司；光学显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪；qTOWER3 touch荧光定量PCR仪[中机科仪(北京)]。

1.2 方法

1.2.1分组及处理 采用随机数字表以简单随机分组法将20只小鼠分为对照组和暴露组各10只，对照组留于SPF级动物中心饲养，实验组在对照组基础上注射24 mg/kg.b.w.PM2.5悬液予以PM2.5暴露，持续暴露12周。24 mg/kg.b.w.PM2.5悬液的制备：于重庆市区内露天环境中进行采样，采样时间为2019年11月至2020年5月，采样仪器：Thermo Anderson大气颗粒物采样器(GV2630)，在采样完成后，将玻璃剪碎成1.5 cm×1.5 cm小片，置于适量的生理盐水中，以超声振荡器(KQ-250DE，中国舒美)超声震荡4×40 min，得到PM2.5悬液，以Thermo冷冻干燥机(LL3000，美国)冻干12 h，得到固体PM2.5，后储存在-80 ℃冰箱中，使用前以无菌生理盐水制成24 mg/kg.b.w.PM2.5悬液。

1.2.2标本取材及处理 各组小鼠处理结束后麻醉、处死，收集血液、睾丸、附睾等标本。每组各取出10个睾丸经Bouin液固定、脱水、石蜡包埋，用于免疫组织化学检测；每组各取10个睾丸立即放入液氮冻存，用于基因和蛋白检测；每组血液标本经离心处理用于ELISA检测；附睾立即置于PBS缓冲液中，进行生殖功能检测实验。睾丸组织取出后放入4%多聚甲醛固定，室温固定24 h，12 h取出睾丸并对切，充分固定，后予以梯度脱水、浸蜡、包埋处理。

1.3 观察指标

1.3.1生殖功能检测 主要包括睾丸与附睾指数、精子计数、精子活动率、精子畸形率、精子成活率，其中精子活动率检测依据WHO推荐的方法，按照精子泳动图将精子活动分为Ⅰ～Ⅳ级，精子活动率=(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级)/(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级+Ⅳ级)×100%。

1.3.2血睾屏障及间质细胞功能检测 将考马斯亮蓝溶液沿着血管注射，肉眼观察考马斯亮蓝在睾丸的通透情况并拍照，分析血睾屏障通透性；经免疫荧光组织化学法[8]检测Sertoli细胞骨架Vimentin、Actin分布与形态变化，透射电子显微镜观察生精细胞间紧密连接时空变化，观察睾丸间质细胞结构。

1.3.3酶联免疫吸附试验 应用ELISA快速检测试剂盒检测各组小鼠睾丸组织匀浆和血清中睾酮(T)、雄性激素结合蛋白(ABP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量。

1.3.4NF-κB/COX-2/PGE2信号通路的检测 实时荧光定量PCR法[9]测定睾丸组织NF-κB/COX-2/PGE2 mRNA的表达，反应体系：正义链(F)1 μl+反义链(R)1 μl+Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，no ROX 12.5 μl+模板4 μl，加水至25 μl。扩增条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。采用ΔΔCt法进行计算，相对表达量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct GI(未知样本)-Ctβ-actin(未知样本)]-[Ct GI(校正样本)-Ctβ-actin(校正样本)]，其中GI为目的基因，β-actin为管家基因作为校正起始模板。Western blot法[9]测定睾丸组织NF-κB/COX-2/PGE2蛋白的表达情况。将少量组织(约0.1 g)放入无菌2 ml EP管中，添加组织裂解液1 ml及蛋白酶抑制剂10 μl，静置，后匀浆、裂解组织、离心，采用BCA蛋白提取试剂盒进行检测，后予以SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗原抗体反应，测3次取平均值。采用半定量评分系统评定效果。

1.4 统计学方法应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验；计数资料以例数(百分率)表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生殖功能指标比较暴露组睾丸系数、附睾系数、精子计数、精子活动率与精子成活率低于对照组，而精子畸形率高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组生殖功能指标比较

2.2 考马斯亮蓝染色结果考马斯亮蓝染色发现，对照组(图1a)淡染的睾丸支持细胞生长较均匀，自然伸展且相互连接，细胞骨架以纵向分布为主，呈均匀分布；暴露组(图1b)细胞质骨架逐渐松弛回缩甚至断裂、消失，分布紊乱，生精细胞脱落。

图1 考马斯亮蓝染色结果(×200) a：对照组；b：暴露组

2.3 免疫组化染色结果免疫组化法发现，与对照组(图2a)相比，暴露组(图2b)睾丸间质细胞体积变小，染色加深，细胞核固缩，胞浆含量少，少部分内质网出现水肿，细胞内异染色质增多。

图2 免疫组化染色结果(×6000) a：对照组；b：暴露组

2.4 酶联免疫吸附试验检测结果暴露组睾丸组织匀浆及血清中T、ABP表达水平低于对照组，而TNF-α、IL-1与IL-6水平高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 酶联免疫吸附试验检测结果比较

2.5 两组NF-κB、COX-2、PGE2表达水平暴露组NF-κB、COX-2、PGE2的mRNA表达水平及蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05)。见图3、表3、表4。

图3 两组NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表达水平(Western blot法)

表3 两组NF-κB、COX-2、PGE2 mRNA表达水平比较

表4 两组NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表达水平比较

3 讨论

氧化应激是大气颗粒物引起机体损伤的主要机制，而活性氧自由基(ROS)为正常有氧代谢过程中产生的有害副产物，颗粒物暴露能引起ROS增多破坏了这一平衡[10]。大气颗粒物的细胞毒性主要机制为通过氧化应激产生，其中PM2.5可深入机体肺泡并沉积，对机体的呼吸系统造成损伤，也可激活相关通路引起睾丸组织发生氧化应激，造成精子质量损害，精子质量降低可能是因大气细颗粒物暴露产生的氧化应激所致[11]。目前PM2.5对雄性生殖健康影响已引起关注，相关研究逐渐增多，但多数研究主要涉及一般生殖毒性指标的观察[12，13]。NF-κB为一类关键性的核转录因子，通常以同源或异源二聚体非活性形式存在于几乎所有类型细胞的胞质，COX-2也是重要的氧化应激相关因子，有研究发现[14]，NF-κB/COX-2途径的解旋酶驱动激活介导人肿瘤微环境中dsRNA驱动的炎症免疫抑制成分，而PGE2为花生四烯酸经环加氧酶催化的代谢产物，与多种疾病发生发展有关[15]，但PM2.5引起的氧化应激损伤及雄性生殖功能障碍是否与NF-κB/COX-2/PGE2信号通路有关目前未见报道。

精液液化时间、精液pH值、精子浓度、精子活力、正常形态率及异常形态率等精液参数均可作为男性不育的评估指标。本次发现，暴露组睾丸系数、附睾系数、精子计数、精子活动率、精子成活率低于对照组，而精子畸形率高于对照组，这与曹希宁[9]的研究有相似之处，表明PM2.5的持续暴露可能引起雄性大鼠生殖功能障碍。氧化应激可通过对雄性生殖系统的损伤而影响男性生育能力及对子代的表观遗传，表现为类固醇激素合成下调，最终影响雄性生育力及子代相关基因的表达[16]。PM2.5为环境空气中空气动力学直径<2.5 μm的颗粒物，其面积较大，活性强，易于附带有毒、有害物质等，同时可诱导睾丸组织产生过量ROS，导致机体氧化应激损伤，从而影响生殖功能[17]。

间质细胞为睾酮主要来源，能保证睾酮局部较高浓度，此为完成精子发生所必需的条件，支柱细胞Sertoli对卵泡刺激素(FSH)起反应，产生雄激素结合蛋白(ABP)、抑制素(inhibin)，并组成血睾屏障。本次考马斯亮蓝染色及免疫组化染色表明，PM2.5的长时间暴露可引起雄性小鼠睾丸间质细胞结构及血睾屏障，PM2.5暴露后可破坏正常的抗氧化防御系统，减少超氧化物歧化酶的含量，增加脂质过氧化物丙二醛含量，最终导致睾丸氧化应激及生殖功能不良发展[18]。此外本次暴露组睾丸组织匀浆及血清中T、ABP表达水平低于对照组，而TNF-α、IL-1、IL-6水平高于对照组，表明PM2.5暴露后可能引起全身炎症反应，睾丸血管炎症性病变，血睾屏障破坏，大量的炎症因子进入睾丸，使之发生炎症反应，从而影响生殖功能。

精子质膜富含的高浓度多不饱和脂肪酸对氧化损伤较敏感，质膜较容易因其受到破坏，此外精子细胞核缺乏对氧化应激的抵抗力，易受此影响而出现DNA损伤，而睾丸组织的氧化应激易造成精子质量损害。本次结果表明PM2.5暴露后引起雄性生殖功能损伤可能与上调NF-κB/COX-2/PGE2信号通路有关。NF-κB信号通路为体内一条非常经典的信号通路，其参与细胞增殖、凋亡、分化等相关基因表达调控[19]，PGE2不仅可直接刺激神经末梢引起疼痛，也能提高痛觉感受器对其他致痛因子的敏感性诱发P物质等释放增加，COX-2为PGE2生成的主要限速酶[20]。Yin等[21]的研究表明，PM2.5可激活血管内皮细胞COX-2/PGES/PGE2的炎性轴，从而促进细胞凋亡和炎症反应，本研究也得出的相似结论。我们推测PM2.5暴露后可引起全身炎症反应，睾丸血管炎症性病变，血睾屏障破坏，大量的炎症因子进入睾丸，激活NF-κB/COX-2/PGE2信号通路，破坏Sertoli细胞功能，从而导致生殖细胞发育、分化为成熟精子障碍，进而引起精子数量和质量的异常，最终导致雄性不育。但本次研究条件有限，未对小鼠睾丸Sertoli细胞进一步进行分离培养观察，后期将进一步开展体外实验，深入探究PM2.5对NF-κB/COX-2/PGE2信号通路的影响。