麻杏石甘汤和银翘散体外抗流感病毒的作用机制分析

杨毅，洪智林

常德市第四人民医院中西结合老干科，湖南常德 415000

麻杏石甘汤出自中医经典著作《伤寒论》，在风寒郁而化热或外感风热中应用，银翘散出自中医经典著作《温病条辨》，在外感风热、热邪犯肺证中应用，二者均在外感病风邪袭肺征中应用[1]。相关医学研究表明，麻杏石甘-银翘散组方能够在极大程度上有利于H1N1感染患者发热时间的缩短，类似于奥司他韦组，这就将可靠依据提供给了临床应用二者治疗流感[2-3]。相关医学研究表明，麻杏石甘汤一方面能够有效改善肺部超微结构，另一方面还能够有效改善甲型流感病毒感染引发的肺部炎症，银翘散能够保护流感病毒FM1株感染的小鼠[4-5]。该研究2020年10月30日购买石家庄以岭药业股份有限公司提供的麻杏石甘汤、银翘散药物粉剂，分析了麻杏石甘汤和银翘散体外抗流感病毒的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2020年10月30 日购买石家庄以岭药业股份有限公司提供的麻杏石甘汤、银翘散药物粉剂。麻杏石甘汤具体药方为炒苦杏仁170 g，炙麻黄170 g，甘草170 g，石膏510 g；银翘散具体药方为金银花204 g，连翘204 g，鱼腥草204 g，绵马贯众204 g，板蓝根204 g，红景天68 g，薄荷脑6 g。用70%乙醇加热炙麻黄、鱼腥草、连翘，回流提取2次，第1次、第2次分别2、1.5 h，滤过提取液，将乙醇回收过来，备用。用水煎煮2次，第1次、第2次分别1.5、1 h，滤过碱液，在60℃温度下合并浓缩各滤液到相对密度1.10~1.15，在此过程中严格按药物组成，然后将乙醇加入其中，使含醇量为70%，之后在4℃的温度下冷藏1 d。将浓度为400 mg/mL的母液配制出来，储存在4℃的温度下备用。将Sigma公司生产的奥司他韦强酸盐（批号：1717-003A9）设定为阳性对照药。购买美国ATCC公司生产的人支气管上皮细胞16HBE、狗肾细胞MDCK，将DMEM培养基、MEM培养基（含10%胎牛血清）作为细胞生长液，并将1%青-链霉素添加其中。购买美国ATCC公司生产的流感病毒株[A/PR/8/34（H1N1）、A/Chicken/Guangdong/1996（H9N2）、A/Guangzhou/GIRD02/09 （H1N1）、A/Duck/Guangdong/09（H6N2）、B/Lee/1940]，使用前用鸡胚扩增，对病毒半数组织感染量（TCID50）进行测定，在此过程中运用Reed-Muench法，在-80℃的温度下储存毒株备用。

1.2 试剂与仪器

实验所需的试剂与仪器见表1。

表1 试剂与仪器

1.3 方法

1.3.1 药物对细胞半数毒性浓度（TC50）测定 在96孔板上每孔（5 000个细胞）中滴加0.1 mL MDCK细胞悬液，在37℃、5%CO2培养箱中放置，培养1 d，待细胞长成单层，换无血清培养基，其含不同药物浓度，其中麻杏石甘汤、银翘散、奥司他韦分别为0.31～20 mg/mL、0.31～20 mg/mL、31.25～1 000μmol/L，2倍稀释， 将6个复孔设置在每个药物浓度。每天在倒置显微镜下对细胞病变情况进行观察，2 d后将细胞病变（CPE）记录下来，按6级标准记录细胞出现CPE，即细胞未出现病变、具有正常的生长评定为-，细胞病变/整个单层细胞＜10%、10%～24%、25%～49%、50%～74%、75%～100%分别评定为±、+、++、+++、++++。在病毒组细胞病变++++时用5 mg/mL MTT染色活细胞。在A490 nm波长处采用全波长多功能酶标仪对OD值进行测定，对实验数据进行统计，将TC50计算出来，在此过程中运用Reed-Muench法。麻杏石甘汤、银翘散、奥司他韦的TC0分别为3 mg/mL、0.5 mg/mL、＞1 000μM，TC50分别为6.16 mg/mL、0.73 mg/mL、＞1 000μM。

1.3.2 药物对病毒半数有效浓度（IC50）测定 在96孔板上每孔（5 000个细胞）中滴加100μl MDCK细胞液，放置在37℃、5%CO2培养箱中，培养1 d，待细胞长成单层，用1×PBS对细胞进行2次洗涤，将100μl 100 TCID50病毒液 （MEM培养基稀释）加入到每孔中，在37℃、5%CO2培养箱中放置，孵育2 h，然后换用不同浓度药液 （MEM培养基稀释-含1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶），其中麻杏石甘汤、银翘散、奥司他韦分别为0.0625～4 mg/mL、0.015～1 mg/mL、3.125～200μmol/L，2倍比稀释，继续在37℃、5%CO2培养箱中培养2 d。对病毒组细胞病变情况进行观察，该过程在显微镜下进行，2 d后在细胞病变为++++时，将病变情况记录下来，并用MTT染色活细胞，在A490 nm波长处采用全波长多功能酶标仪对OD值进行测定，对实验数据进行统计，将IC50计算出来。用选择指数（SI）表示药物对病毒的有效性， 其计算方法为TC50/IC50，＜1、1～2、＞2分别表示无效、高毒低效、低毒高效[6]。

1.3.3 药物对病毒诱导细胞因子及趋化因子基因调节作用的qPCR法测定 将1 mL 16HBE细胞悬液滴加到12孔板上的每孔中，每孔20 000个细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养1 d，待细胞长成单层，用1×PBS对细胞进行2次洗涤，将500μl 104 TCID50 A/PR/8/34病毒液（DMEM培养基稀释）加入到每孔中，在37℃、5%CO2培养箱中放置，孵育2 h，然后将病毒液吸走，之后将含不同浓度的药物加入，麻杏石甘汤、银翘散的最大无毒浓度TC0分别为3、0.5 mg/mL。继续在37℃、5%CO2培养箱中培养1 d，之后将上清液收集起来，并用TRIZOL将细胞提取出来，在1.5 mL EP管中分装，将细胞RNA提取出来，在此过程中运用氯仿-异丙醇-乙醇抽提法，然后逆转录RNA为cDNA，在此过程中应用TaKaRa逆转录试剂盒，之后运用PCR法对每个样品炎症因子表达水平进行测定，在此过程中应用TaKaRa qPCR试剂盒。在ABI 7500 real time PCR System机器伤对样品的表达水平进行测定，用CT值表示，用2-△△α方法计算的倍数变化表示结果 （和未感染细胞相比）[7]，将内参设定为GAPDH。

1.3.4 药物对病毒诱导IL-6、IP-10蛋白调节作用的ELISA法测定 对细胞上清液中炎症因子IL-6、IP-10分泌进行测定，在此过程中应用ELISA检测试剂盒。

1.4 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件予以数据处理，计量资料用（±s）表示，组间差异比较采用t检验、方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麻杏石甘汤、银翘散体外对流感病毒的药效比较

麻 杏 石 甘 汤 对H1N1、H1N1、B/Lee/1940、H6N2、H9N2的IC50分别为 （0.142±0.040）、（0.380±0.081）、（0.432±0.015）、（0.395±0.051）、（0.724±0.204）， 对5种流感病毒的IC50在0.1～1 mg/mL之间，体外在一定程度上抑制流感病毒；银翘散体外不直接抑制流感病毒。见表2、表3。

表2 麻杏石甘汤、银翘散体外对流感病毒的药效比较（IC50）

表3 麻杏石甘汤、银翘散体外对流感病毒的药效比较（SI）

2.2 麻杏石甘汤、银翘散体外对细胞因子基因表达的作用

麻杏石甘汤对IP-10、IL-6的基因表达下调作用显著高于病毒组，差异有统计学意义 （t=4.303、3.182，P＜0.05），麻杏石甘汤、银翘散均将CCL5、IP-10、TNF-α、IL-6、IL-8的基因表达下调，差异有统计学意义（F=6.965、4.541，P＜0.05）， 其中3 mg/mL麻杏石甘汤下调IP-10、IL-6的基因表达分别80倍、103倍左右，0.5 mg/mL银翘散下调IP-10、IL-6的基因表达分别18倍、3.7倍左右。麻杏石甘汤能够将COX-2的基因表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），银翘散能够将MIG的基因表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 qPCR法检测麻杏石甘汤和银翘散对细胞因子基因的调节作用

2.3 麻杏石甘汤、银翘散体外对IP-10、IL-6蛋白的调节作用

麻杏石甘汤、银翘散均能够将IP-10、IL-6的蛋白表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），3 mg/mL麻杏石甘汤下调IP-10、IL-6蛋白的表达分别11倍、97倍左右，0.5 mg/mL银翘散下调IP-10、IL-6蛋白的表达分别11倍、3.5倍左右。见图2。

图2 ELISA法检测麻杏石甘汤和银翘散对IP-10和IL-6蛋白的调节作用

3 讨论

麻杏石甘汤属汤剂。可辛凉宣泄，清肺平喘。这样的药物主要是主要成份为麻黄碱，具有镇咳、平喘、化痰、散热的功效，临床上对于风寒感冒有一定的功效。麻杏石甘汤方中甘草能够流感病毒吸附细胞进行抑制，同时将病毒诱导的细胞因子CCL5、IP-10、IL-6下调[8]。银翘散的功效为辛凉透表、清热解毒，主要用于小便灼热等不适症状。银翘散方中连翘、金银花的主要功效为清热解毒，能够对病毒介导的炎症进行调节[9]。

杨菊芳等相关医学学者比较了流感治疗中麻杏石甘汤、银翘散2个经典复方的功效[10-11]，结果表明，麻杏石甘汤一方面能够直接抗病毒 （对流感病毒的IC50在0.1 mg/mL以上），另一方面还能够对病毒介导炎症进行抑制，但仍然需要后续实验进一步炎症其作用机制，而银翘散只将抗炎药效发挥了出来。该研究结果表明，麻 杏 石 甘 汤 对H1N1、H1N1、B/Lee/1940、H6N2、H9N2的IC50分别为 （0.142±0.040）、（0.380±0.081）、（0.432±0.015）、（0.395±0.051）、（0.724±0.204），对5种流感病毒的IC50在0.1~1 mg/mL之间，体外在一定程度上抑制流感病毒；银翘散体外不直接抑制流感病毒。麻杏石甘汤对IP-10、IL-6的基因表达下调作用显著高于病毒组（P＜0.05），麻杏石甘汤、银翘散均将CCL5、IP-10、TNF-α、IL-6、IL-8的基因表达下调（P＜0.05）。银翘散能够将MIG的基因表达下调 （P＜0.05），麻杏石甘汤能够将COX-2的基因表达下调（P＜0.05）。麻杏石甘汤、银翘散均能够将IP-10、IL-6的蛋白表达下调（P＜0.05），和上述研究结果一致。

综上所述，麻杏石甘汤能够直接抗病毒、对病毒介导炎症进行抑制，银翘散只有抗炎药效。