肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠模型建立初探

左禧萌,史晓光,,刘洁丽,,杨臻瑞,,高 翔,,赖 瑞,,赵 泽,,汪唐顺

(北京中医药大学东直门医院普通外科,北京100700)

肉芽肿小叶性乳腺炎是一类好发于已孕已产妇女的非哺乳期乳腺炎，其临床特点为突发乳房肿块，在短时间内红肿热痛，进而迅速化脓、破溃，形成难以愈合的窦道，侵犯乳房小叶组织；该病常常在不同阶段出现多个病灶发作，给患者造成极大的身心损害。该病目前病因尚不明确，治疗方法以手术治疗与激素冲击治疗为主，但针对剂量、术式等尚未形成统一规范；而且医院的经验性治疗往往参差不齐［1］，通常以患者自身意愿作为手术指征，有时导致非必要的医源性乳房损毁，因此针对该病的最佳治疗方法仍有待探讨［2］。本实验目的是构建合适的肉芽肿小叶性乳腺炎大鼠模型，为临床药物疗效的初步观察提供一个基础平台，并为该病机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 人肉芽肿小叶性乳腺炎病变组织

选取在北京中医药大学东直门医院乳腺科或普通外科就诊的20～45岁肉芽肿小叶性乳腺炎患者5例，住院手术治疗时收集这些患者的乳腺病变腺体组织标本及病灶切缘正常腺体组织标本各5份。由于肉芽肿小叶性乳腺炎的病灶较为广泛，切除范围往往比病灶本身更大，因此从离体病灶样本中挑选无肉芽肿样变的正常乳腺组织是可行的。取材前所有患者均签署知情同意书。标本切取后，每份组织样本约0.5 g，并用2 mL冻存管密封，置于液氮罐内保存，然后经样本库－80℃冰箱保存。本研究方案经过本院医学伦理委员会审批（批号为2017-JYB-JS-063）。

1.2 实验动物

本实验用SD大鼠均有孕产史，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2016-0006］，质量为300～400 g，共计25只。所有实验动物均饲养于北京中医药大学东直门医院SPF级环境屏障动物实验室［SYXK（京）2020-0013］，饲养环境温度为18～29℃，日温差≤3℃，相对湿度40%～70%，全新风换气次数10次／h，气流速度≤0.18 m/s，压差25 Pa，洁净度1万级，氨浓度15 mg/m3，噪音≤60 dB，照度150～300 lx。动物实验方案经北京中医药大学动物福利委员会批准（编号为19-56）。

1.3 主要试剂及仪器

完全弗氏佐剂5881型（Freund's complete adjuvant 5881）购自美国Sigma公司；手持超声波匀浆机购自德国Hiescher公司（型号UP100 H）；光学显微镜购自德国Leica公司（型号DM000LED）。

1.4 病变乳腺组织匀浆液接种物制作[3-5]

将人肉芽肿小叶性乳腺炎组织的液氮保存标本运送至实验室后，封装的组织标本放入37℃恒温水浴箱中复冻。复冻后将冷冻管内组织取出称量，人工研磨至无明显大颗粒组织后，与生理盐水（即0.9%NaCl溶液）按1∶3比例（每1 g组织对应3 mL生理盐水）混合，装入离心管中置于冰上，手持超声波匀浆机做细胞粉碎匀浆处理，进一步粉碎细胞结构，破坏细胞膜，使包浆中的蛋白释放到溶液中。经细胞粉碎后的匀浆取上清液，置于无菌离心管内，与完全弗氏佐剂按体积比为1∶1混匀，制成油包乳混悬液（混匀过程在冰上进行，过程约20 min；注意保持其周围温度为0～4℃，以保持完全弗氏佐剂的活性）。制备好的混悬液即为病变乳腺组织匀浆液，置于4℃保存备用。

1.5 肉芽肿小叶性乳腺炎动物模型的建立及分组

造模用大鼠随机分为5组，每组5只，分别为空白对照组、完全弗氏佐剂组、正常乳腺组织匀浆组、病变乳腺组织匀浆低剂量组和病变乳腺组织高剂量组。SD大鼠入住实验室动物饲养室适应环境3 d，用1.5%戊巴比妥溶液以0.2 mL/100 g的剂量腹腔注射大鼠。麻醉后大鼠固定于木板上，第3和第4对乳房剔除毛发，碘伏溶液消毒皮肤。使用眼科镊提起乳头，使用接种注射器，将每组不同的接种物沿乳头根部斜行进针，进针深度2～4 mm，注入大鼠第3和第4对乳腺内，即可完成人工种植包埋过程，出针后简单按压止血。注意不可进针过深导致接种物被注射至肌层。空白对照组接种0.2 mL生理盐水，完全弗氏佐剂组接种0.2 mL完全弗氏佐剂，正常乳腺组织匀浆组接种正常组织匀浆0.2 mL，病变乳腺组织匀浆低剂量组及高剂量组分别接种病变乳腺组织匀浆0.1 mL和0.2 mL。

1.6 临床观察

各组大鼠接种后，常规维持性饲养。每天对各组大鼠的临床表现进行观察，并记录各组动物的变化，包括大鼠体质量、乳房横径及皮肤颜色。肉芽肿小叶性乳腺炎改变的大鼠往往表现为乳房局部皮肤红肿、乳房横径增大，甚至出现破溃表现。

1.7 HE染色及病理诊断标准

于接种后第14天将全部大鼠以断颈法处死，切取第3对和第4对乳腺组织，注意不要带入毛发及皮肤，清水稍冲洗后放入4%的甲醛溶液中固定。常规石蜡包埋和切片，切片厚度为4μm。取切片理想的乳腺组织，脱蜡后行HE染色，最后脱水封固。光学显微镜下观察乳腺组织形态，进行病理诊断。

病理诊断标准：炎症轻者乳腺小叶中可见导管和腺泡成分，终末导管扩张，腔内空虚或含有坏死物，导管及腺泡上皮可萎缩、消失或增生，伴淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润，小叶特化间质疏松，呈水肿样改变。炎症重者上皮成分破坏或消失，有大量中性粒细胞为主的炎细胞浸润，可见上皮样细胞和多核巨噬细胞，多核巨噬细胞为朗格汉型或杜顿型，极少或无异物型，巨噬细胞内无Schaumann小体，大多数病例的小叶中央可见小脓肿和脂质空泡。病变融合者的小叶结构消失，形成大片状和（或）结节状慢性化脓性肉芽肿性病灶，并可形成脓肿、皮肤破溃及窦道；小叶内、小叶间导管周围见多种炎性细胞浸润，以嗜中性粒细胞为主，可有单核细胞、淋巴细胞；乳腺间质可有纤维组织增生和（或）硬化，亦可见有小血管炎。因此，病理组织中可见慢性化脓性肉芽肿性病灶，并伴有炎性细胞浸润，且以巨噬细胞及中性粒细胞为主，则可诊断为肉芽肿小叶性乳腺炎［6-8］。

1.8 数据统计及处理

采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析处理。结果数据使用百分比及频次表示，计数资料的组间比较采用卡方检验。以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察

自接种后第1天起，大鼠体质量在各组之间无明显差异。病变乳腺组织匀浆高剂量组与低剂量组均出现肉芽肿小叶性乳腺炎的临床改变，即被接种的乳房出现红肿、体积增大、破溃后不易愈合等表现（图1），而且1只大鼠出现了非接种乳房的肉芽肿小叶性乳腺炎样改变。空白对照组、完全弗氏佐剂组和正常乳腺组织匀浆组均无乳房红肿表现，其中完全弗氏佐剂组有1只大鼠出现了乳腺体积增大，经病理诊断为少量炎性细胞浸润的炎症改变，无明显肉芽肿组织生成。对各组大鼠的临床表现进行每日观察后，记录发病情况见表1。

表1 各组大鼠乳腺发病情况Table1 Morbidity of mammary glandsin theratsof each group（各组n=5）

图1 乳腺病变大鼠外观Figure1 Appearanceof mammary gland lesionsin a rat

2.2 病理诊断

接种2周后处死大鼠，取乳腺组织进行HE染色，病理诊断结果见图2。其中，病变乳腺组织匀浆高剂量组的乳腺小叶完全破坏，大片结节样慢性肉芽肿炎性病灶生成；病变乳腺组织匀浆低剂量组可见乳腺小叶组织边界不清，腺叶内出现空泡，且伴随大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，高倍镜下可见多核巨细胞。完全弗氏佐剂组与正常乳腺组织匀浆组虽然可见少量淋巴细胞浸润，但未见乳腺小叶出现肉芽肿样改变。本研究中仅接种病变乳腺组织匀浆液的组别出现了阳性改变，正常乳腺组织匀浆组、完全弗氏佐剂组、空白对照组均未出现肉芽肿样改变。组间对比使用卡方检验，提示P＜0.001，差异有统计学意义。

图2 各组大鼠乳腺组织HE染色Figure 2 HE staining of rat mammary gland specimens in each group

3 讨论

目前针对肉芽肿小叶性乳腺炎的病因理论假说主要有细菌感染与自身免疫反应两种［9-12］。超声波细胞粉碎机是一种利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器，能用于动植物组织、细胞、细菌、芽胞菌种的破碎，同时可用来乳化、分离、分散、匀化、提取、脱气、清洗及加速化学反应等。由于本实验中病变乳腺组织匀浆经超声破碎，细胞结构已经破坏，不存在细菌及其他细胞，因此本研究中动物模型建立结果说明仅依靠病变组织内活性成分即可导致疾病发作，提示肉芽肿小叶性乳腺炎并非细菌感染性疾病，这为证明该病是由自身免疫反应异常引起提供了一定依据。但是需要说明，病变组织匀浆中也可能存在细菌死亡后释放的内毒素等物质，因此本研究结果并不能否定肉芽肿小叶性乳腺炎与细菌的相关性。除此之外，肉芽肿小叶性乳腺炎的发病原因在本实验中尚无明确体现，仅证明了人肉芽肿乳腺炎匀浆可导致大鼠乳腺组织发生同类型改变，还无法证明最初引起该病的原因。

本文所用完全弗氏佐剂是一种增强免疫原性制剂，主要作用如下：（1）形成抗原储存库［13］；（2）形成局部肉芽肿；（3）刺激淋巴细胞增殖和分化［14］。上述3点作用均为肉芽肿小叶性乳腺炎的发生提供了需要的条件。既往针对浆细胞乳腺炎的研究提示，经单纯完全弗氏佐剂注射后的乳腺组织会产生中性粒细胞和淋巴细胞浸润，但未发现浆细胞或类浆细胞性乳腺炎改变。本研究中完全弗氏佐剂组也出现了炎性细胞浸润的改变，但不明显，说明完全弗氏佐剂对炎症形成有促进作用，但其单独使用并不能诱导建立病变模型。

除此之外，本实验中1只大鼠出现了除第3、第4对乳房之外其他乳房的红肿改变，经取材后病理观察提示为慢性化脓性炎症肉芽肿性乳腺炎，推测可能是诱发疾病的物质进入血液循环导致疾病在其他乳房发生。另外，1只注射了单纯完全弗氏佐剂的大鼠出现了乳房腺体下油包乳溶液的炎性包裹，但光学显微镜下病理诊断提示非肉芽肿小叶性乳腺炎改变，可能是由于注射操作失误导致完全弗氏佐剂未被大鼠乳腺吸收。

本次实验的优点是建立了首个肉芽肿小叶性乳腺炎动物模型，该模型与人肉芽肿小叶性乳腺炎相近且造模时间较短，而且其发病过程受注射抗原剂量影响可控。本实验的缺点是样本量较小，需要进一步扩大样本量做验证实验；另外，本实验建立的模型尚无法针对患者下肢红斑、关节疼痛等症状进行模拟［15］，有待后续进一步改进。

综上所述，本实验为肉芽肿小叶性乳腺炎动物造模提供了一个新思路，通过对造模动物的干预，或许在未来可以找到除激素冲击治疗之外疗效迅速、治愈率高的新的用药方式，从而进一步对肉芽肿小叶性乳腺炎的病因学做深入研究。