宫颈癌中Hippo-Yes相关蛋白1、雷帕霉素靶蛋白的表达及临床意义

郭历琛，杨 欢，石 琴，张 锐

(上海健康医学院附属嘉定区中心医院妇产科，上海 201800)

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，发病率位居女性恶性肿瘤前三，全球每年新发病例超50万，发展中国家病例约占4/5[1]。随宫颈癌筛查普及率的上升，宫颈癌检出率上升，死亡率下降，但有明显年轻化趋势[2]。现今仍未完全阐明宫颈癌发病机理，多认为与多次孕产史、性生活紊乱及人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相关[3，4]。近年来也有证据显示，宫颈癌发病累及多基因、多步骤，与原癌基因激活、抑癌基因丧失及突变存在紧密联系[5]。Hippo-Yes相关蛋白1(Hippo-Yes associated protein 1，YAP1)由YAP1基因编码，属富脯氨酸磷蛋白，为Hippo信号通路下游转录共激活因子，其表达异常或基因突变对细胞增殖、凋亡基因调节产生影响，导致Hippo-YAP通路调节异常，引起靶基因转录活性上升，诱导肿瘤形成。已发现YAP1与卵巢癌发生及进展有关[6]。YAP1参与多种信号转导通路，可维持细胞的增殖以及凋亡之间的平衡，在胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target protein of rapamycin，mTOR)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷酸肌醇3/蛋白激酶B信号通路调节因子，承担多种蛋白转录、翻译功能，与细胞生长、凋亡、自噬密切相关[7]。mTOR信号通路能够调节和肿瘤发生有关的细胞增殖、细胞周期等多种细胞功能，其失调和肿瘤形成具有紧密关联性。前期报道发现，mTOR信号异常活化与乳腺癌发生有关，并影响其预后[8]。对于YAP1、mTOR蛋白能否在宫颈癌中的起到调节和平衡作用目前还未完全清楚。为探究YAP1、mTOR与宫颈癌病理特点的关系，本文对收治的92例宫颈癌、50例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及50例子宫肌瘤女性宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达进行检测，探讨YAP1、mTOR在宫颈癌组织中的表达及意义，以期为宫颈癌防治提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年1月至2020年1月我院收治的宫颈癌患者92例作为宫颈癌组，获取手术切除癌组织标本92份。同期收治的50例CIN患者作为CIN组，获取宫颈组织病理切片50份。同期因子宫肌瘤接受手术治疗但宫颈功能正常的50例患者作为对照组，获取宫颈组织病理切片50份。入选标准：宫颈癌组均经手术病理确诊为宫颈癌；CIN组均行宫颈锥切术，病理切片证实为CIN；对照组均行全子宫切除均病理证实宫颈组织正常；年龄均超过22岁；病历资料完善，有完整随访资料。排除标准：合并其他恶性肿瘤；宫颈癌复发；严重心肝肾肺功能不全；严重脑血管疾病；精神疾病；孕期或哺乳期女性；所获取标本不满意；临床资料不全。宫颈癌组年龄29～74岁[(49.51±10.76)岁]；分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期41例，Ⅲ期20例；病理类型：鳞癌75例，腺癌17例；病理分化程度：低分化20例，中分化45例，高分化27例；神经脉管侵犯54例，宫旁侵犯52例，淋巴结转移48例。CIN组年龄27～72岁[(47.96±11.52)岁]。对照组年龄26～70岁[(48.11±10.79)岁]。

1.2 方法

1.2.1主要试剂与仪器 兔抗人mTOR单克隆抗体(抗体稀释浓度1：100)、鼠抗人YAP1单克隆抗体(抗体稀释浓度1∶400)均购自美国Abcam公司，即用型S-P试剂盒(过氧化物酶阻断剂、生物素标记二抗、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶)购自瑞士罗氏公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，苏木素、二甲苯均购自美国Invitrogen公司；Axio Imager M2 m全自动显微镜购自德国蔡司公司。

1.2.2免疫组化染色法测定组织YAP1、mTOR蛋白表达 采用免疫组化染色法测定宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达，具体如下：三组宫颈组织石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，热抗原修复，3%过氧化氢孵育10 min，分别加入鼠抗人YAP1单克隆抗体(1∶400稀释)、兔抗人mTOR单克隆抗体(1∶100稀释)，4 ℃恒温过夜，滴加过氧化物酶标记二抗(1∶2000稀释)，孵育60 min，加入DAB显色剂显色，苏木素复染1 min，梯度乙醇分化30 s，氨水返蓝1 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，磷酸盐缓冲液作为阴性对照。

1.3 结果判定[9]每切片随机取5个高倍视野观察YAP1、mTOR阳性染色情况。YAP1阳性产物定位于细胞浆与细胞核，呈淡黄色、棕黄色、棕褐色染色；mTOR阳性产物定位于细胞质与细胞核，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色染色。依据阳性染色数目及染色程度评估阳性情况。阳性数目占比：0分(无阳性细胞着色)，1分(阳性细胞数目占10%)，2分(阳性细胞数目占11%～50%)，3分(阳性细胞数目占51%～80%)，4分(阳性细胞数目超过80%)；染色强度：0分(无着色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)。最终评分结果为阳性染色占比与染色程度评分乘积，阳性：乘积>4分。

1.4 统计学方法数据处理采用SPSS 20.0统计学软件。计量资料以均数±标准差表示，多组计量数据对比进行单因素方差分析，组间独立样本t检验；计数资料用[(n)%]表示，χ2检验或Fisher确切概率分析，采用Spearman相关分析法分析宫颈癌癌组织YAP1与mTOR表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率比较CIN组、宫颈癌组宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率高于对照组(P<0.05)，宫颈癌组YAP1、mTOR蛋白表达阳性率又高于CIN组(P<0.05)，见表1与图1～图2。宫颈癌组宫颈组织YAP1蛋白表达于细胞质、细胞核，mTOR阳性产物多表达于细胞质，呈棕褐色、棕黄色染色，着色程度高，阳性染色细胞比例高；CIN组宫颈组织YAP1、mTOR阳性产物多呈浅着色，阳性染色细胞比例少；对照组宫颈组织YAP1、mTOR蛋白着色程度低，阳性染色细胞比例极少。

图1 三组宫颈组织YAP1蛋白表达情况(HE×200) a：对照组；b：CIN组；c：宫颈癌组

2.2 不同病理特点宫颈癌患者宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率不同年龄、病理类型宫颈癌患者宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，临床分期为Ⅲ期、分化程度为低分化、伴宫旁侵犯、脉管侵犯及淋巴结转移的宫颈癌患者宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、病理分化程度为中高分化、不伴宫旁侵犯、不伴脉管侵犯及无淋巴结转移的宫颈癌患者(P<0.05)，宫颈浸润深度>1/3的宫颈癌患者mTOR阳性率高于宫颈浸润深度≤1/3的宫颈癌患者(P<0.05)，见表2。

表2 不同病理特点宫颈癌患者宫颈组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率比较 [n(%)]

2.3 宫颈癌癌组织YAP1与mTOR表达相关性分析92例宫颈癌患者mTOR阳性79例中YAP1阳性65例，13例mTOR阴性患者中YAP1阴性9例；Spearman相关分析显示，宫颈癌癌组织YAP1、mTOR表达呈正相关(r=0.489，P<0.05)，见表3。

表3 宫颈癌癌组织YAP1与mTOR表达相关性分析

3 讨论

YAP1蛋白为近年来发现Hippo信号通路下游关键转录共激活蛋白，承担促组织再生、维持干细胞自我更新、修复等生物学功能。最新研究发现，YAP1参与细胞增殖、凋亡调节及肿瘤形成过程，在较多恶性肿瘤均呈高表达，且能促进癌细胞增殖、分化及侵袭[10]。本研究发现，宫颈癌患者癌组织YAP1蛋白表达阳性率高于CIN与对照组，随宫颈病变的进展，YAPI阳性率上升，与前期研究结论存在共性，推测YAP1可能为一类致癌基因，参与宫颈癌发生及进展过程。考虑YAP1为Hippo通路中心信号分子，YAP1过表达时，该通路下游靶信号激活，YAP1发生去磷酸化反应，活性增加，细胞核内转移及聚集，与转录因子结合促进结缔组织生长因子等下游靶基因增殖，诱导癌细胞相关基因异常表达，抑制凋亡基因过表达，发挥促增殖及凋亡抵抗作用，打破细胞增殖、凋亡调控平衡，导致癌细胞过度增殖，诱导宫颈癌发生及进展。国外有报道指出，YAP1细胞核内蓄积与卵巢癌恶性生物学行为有关[11]。本研究发现，YAP1蛋白高表达宫颈癌患者病变程度更高，分化更差，更易出现脉管侵犯、宫旁侵犯、淋巴结转移，得出与上述卵巢癌中相似结论，说明YAP1蛋白可能与宫颈癌恶性程度有关。推测YAP1高表达可能直接影响宫颈癌癌细胞增殖、分化，提高癌细胞侵袭性，导致癌细胞向恶性表型转化。但本研究尚未显示不同宫颈浸润深度宫颈癌患者YAP1阳性表达差异，与Serrao等[12]结论存在区别，分析可能与本研究样本数量少、病例纳入标准不同有关，后续需进一步扩充样本量论证该结论。

mTOR为丝/苏氨酸下游基因，可通过调节细胞增殖、迁移及影响放化疗耐药等途径参与多种肿瘤发生与进展过程。有研究指出，mTOR可通过与Rho A/Rac 1酶作用促进细胞重塑与上皮间质转化，促进结肠癌侵袭及进展[13]。Webb等[14]发现，mTOR活化后可调控真核细胞翻译起始因子结合蛋白磷酸化反应，参与蛋白质转录、翻译过程，调控细胞增殖、分化。但宫颈癌中mTOR的作用目前尚未完全阐明。本研究结果显示，宫颈癌患者癌组织mTOR表达阳性率高于CIN与对照组，且在宫颈病变早期mTOR即存在，随宫颈病变的发展而表达增多；且病理分化程度越差、临床分期越高、宫颈浸润深度高，且伴宫旁侵犯、脉管侵犯、淋巴结转移的宫颈癌患者mTOR阳性率更高，支持Bahrami等[15]研究结论，证实mTOR高表达可能促成宫颈癌发病及进展。推测mTOR活化可促使宫颈上皮细胞致癌因子活化，导致宫颈上皮细胞异常增殖，影响自身凋亡机制，介导增殖、凋亡失衡，导致癌细胞异常增殖，诱导宫颈癌发生。有研究表明，YAP1通路能够对mTOR信号通路起到激活作用，使细胞生长重组，在肿瘤的发证以及发展中发挥重要作用[16]。本研究还发现，宫颈癌患者癌组织YAP1、mTOR蛋白表达互相呈正相关，推测两者可能协同参与宫颈癌细胞增殖、凋亡失衡调节过程，考虑两者均可通过促癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡的途径诱导宫颈癌发病及进展，或可能存在相似的机制，有待进一步展开体内外研究证实。

综上，宫颈癌患者癌组织YAP1、mTOR蛋白表达阳性率高于CIN与正常宫颈组织，两者均与宫颈癌发生及进展有关，随宫颈癌分期的上升、分化程度的变差、肿瘤侵犯范围的增加，YAP1、mTOR阳性率增加，两者可能协同参与宫颈癌发生及进展过程，可能为宫颈癌防治的新靶点。由于观察时间尚短，本研究尚未明确YAP1、mTOR蛋白表达对宫颈癌近远期预后的影响，有待跟踪随访后充实本结论，作为下一步研究的新方向。